基本原理
玫瑰花環(huán)試驗(yàn)是體外檢測人和動物細(xì)胞免疫功能的一種方法。E—玫瑰花環(huán)試驗(yàn)是T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的一種重要方法。由于人和動物的T淋巴細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體,因此紅細(xì)胞可以粘附到T淋巴細(xì)胞的周圍而形成玫瑰花樣的細(xì)胞團(tuán)。在紅細(xì)胞中,以綿羊紅細(xì)胞最為常用。B淋巴細(xì)胞則沒有紅細(xì)胞受體,所以不能形成E—玫瑰花環(huán),以資鑒別。
材料與試劑
1.肝素抗凝劑
2.淋巴細(xì)胞分層液 配制方法見細(xì)胞分離技術(shù)。
3.無Ca2 、Mg2 Hank’s液
NaCl 4.00g
NaHCO3 0.175g
KCl 0.20g
Na2HPO4.12H2O 0.076g
KH2PO4 0.030g
葡萄糖 0.50g
H2O加至 500.00ml
用5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2,115℃15min滅菌。4℃貯藏備用。
4.5.6%NaHCO3液
NaHCO3 5.60g
H2O 100.00ml
115℃20min滅菌, 4℃貯藏備用。
5.0.8%戊二醛溶液
25%戊二醛溶液 0.32ml
Hank’s液 9.68ml
用前配制。
6.Giemsa—weight染色液
Giemsa粉 0.03g
Weight粉 0.30g
甲醇 100.00ml
先將染料一起放入研缽內(nèi),加入少量甲醇,研磨細(xì),然后倒入瓶內(nèi),并用甲醇沖洗研缽內(nèi)染料,一起倒入玻瓶內(nèi),補(bǔ)足甲醇量,備用。
操作方法
1.取肝素抗凝血2ml,置37℃水浴自然沉淀30min~40min,吸取全部血漿(約1ml)。
2.于血漿中加Hank’s液數(shù)毫升,洗滌,1 500r/min離心5min~10min,棄上清。重復(fù)洗滌4次,沉淀均勻即為淋巴細(xì)胞懸液。
3.采綿羊肝素抗凝血,加數(shù)倍Hank’s液,洗滌3次,最后以Hank’s配成10%懸液,4℃保存。
4.取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液,加10%紅血球懸液0.1ml,加小牛血清0.1ml。
5.37℃水浴10min,低速離心(600r/min)5min。
6.吸棄多余的上清液后,放入4℃冰箱2h~4h。
7.取出后,將沉淀輕輕搖起,加0.8%戊二醛0.1ml,混勻后4℃固定15min。
8.將干凈的玻片用Hank’s液沾濕,滴一小滴混懸液,讓其自然散開即可。
9.自然干燥后,用姬姆薩—瑞氏液(Giomsa—weight)或蘇木精—伊紅染色,水洗,干燥鏡檢。
結(jié)果判定
凡一個淋巴細(xì)胞結(jié)合3個或3個以上的紅細(xì)胞者為一個E—玫瑰環(huán)。檢查200個淋巴細(xì)胞,計(jì)算其玫瑰花環(huán)形成率。
注意事項(xiàng)
1.影響E—玫瑰花環(huán)試驗(yàn)最主要的因素淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的新鮮程度,被檢血樣必須新鮮,無菌,采血后要求在3h~4h內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn),否則由于淋巴細(xì)胞的死亡,受體脫落,影響檢查結(jié)果。紅細(xì)胞用阿氏液保存最多不要超過3周,且不應(yīng)溶血。
2.控制好反應(yīng)溫度、時間等條件對玫瑰花環(huán)形成率有較大影響。選37℃作用10min,低速離心5min,置4℃ 2h~4h,其結(jié)果穩(wěn)定性較好,結(jié)合率較高。如在37℃作用時間較長,可見玫瑰花環(huán)發(fā)生變形,結(jié)合部位松弛、拉開,甚至解離。
3.指示紅血球的動物種類也與玫瑰花環(huán)的形成率有關(guān)。如馬淋巴細(xì)胞與豚鼠紅細(xì)胞結(jié)合較好,而驢則與綿羊紅血球結(jié)合較好。Melinda氏報(bào)道,人、馬、牛、豬、狗、貓、鼠與豚鼠紅細(xì)胞的結(jié)合率都高于綿羊紅細(xì)胞的結(jié)合率。
4.加犢牛血清能增加玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞的穩(wěn)定性,增強(qiáng)與指示紅細(xì)胞結(jié)合的牢固性。
5.Hank’s液的pH以7.2~7.4為宜。