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    SPA的提取

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

    SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等,F將常用的方法介紹如下:

    1.煮沸提取法

    ⑴ 將菌株接種于蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20h~24h。

    ⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液將菌苔洗下,配成10%(V/V)的懸液。

    ⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷卻至4℃,4 000r/min離心20min,去沉淀。

    ⑷ 以1mol/LHCl將上清液調pH至3.0~3.5,然后4 000r/min離心30min。

    ⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min離心20min。

    ⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,.4 000r/min離心20min。

    ⑺ 沉淀(可直接凍干為粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解,12 000r/min離心20min。

    ⑻ 上清液即為粗提SPA液。

    ⑼ Sephadex G100過柱,上樣后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脫,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。

    ⑽ 測OD275nm值及用對流免疫電泳檢測每管的活性,將有活性的各管合并、濃縮或凍干。

    2.溶菌酶消化法

    ⑴ 將培養(yǎng)的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液配成10%~15%的懸液。

    ⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液與溶菌酶(活力為1萬U/mg蛋白)37℃水溶攪拌24h。

    ⑶ 置4℃冷卻后,以12 000g離心30min。

    ⑷ 取上清,調pH值至7.0。

    ⑸ 加硫酸銨,邊加邊攪拌,使溶液呈80%的飽和度,4℃過夜。

    ⑹ 12 000g離心30min。

    ⑺ 以少量蒸餾水將沉淀溶解。

    ⑻ 透析或過Sephadex G50除鹽,即為粗制的SPA制品。

     

     

     
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