有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩�，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價高）的抗體。
用于免疫的動物
作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
免疫途徑
免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。
佐劑
由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。
常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。
配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆�。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。
免疫方法
抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。
在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。
抗血清的采集與保存
家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
抗血清質(zhì)量的評價
在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。
1．效價 抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。
�。�1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000�？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。
�。�2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。
2．特異性測定 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。
S=y/Z×100%
S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。
3．親合力 在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。
計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。
免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施
有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。
�。�1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)量。
�。�2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。
�。�3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。
�。�4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。
�。�5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。
（6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。
用于免疫的動物
作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
免疫途徑
免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。
佐劑
由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。
常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。
配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆�。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。
免疫方法
抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。
在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。
抗血清的采集與保存
家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
抗血清質(zhì)量的評價
在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。
1．效價 抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。
�。�1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000�？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。
�。�2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。
2．特異性測定 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。
S=y/Z×100%
S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。
3．親合力 在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。
計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。
免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施
有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。
�。�1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)量。
�。�2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。
�。�3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。
�。�4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。
�。�5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。
（6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。