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    SPA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(SPA-ELISA)

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

    SPA-ELISA技術(shù)原理

    SPA 能天然地與人及某些哺乳動(dòng)物的IgG分子上的Fc片段結(jié)合,一個(gè)分子的SPA可以同2個(gè)IgG分子以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合(這不是真正的免疫反應(yīng),又稱(chēng)為假免疫反應(yīng)),利用這個(gè)特性,以SPA代替IgG抗體而應(yīng)用于ELlSA中。


    材料與試劑

    1.SPA-HRP結(jié)合物,可向有關(guān)生物制品廠(chǎng)購(gòu)買(mǎi),也可自制,制法如下:

    (1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。

    (2) 加入0.1ml用無(wú)水乙醇配制的1%的1-熒光-2,4二硝基苯,室溫(20℃)溫和攪拌1h。

    (3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇,室溫?cái)嚢?h。

    (4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液充分透析。

    (5) 加入經(jīng)0.01mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液平衡的SPA 5mg/ml,于20℃溫和攪拌2h~3h。

    (6) 加入5mg KBH4,混勻后,4℃放置3h。

    (7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析過(guò)夜。

    (8) 過(guò)Sephadex G100柱(100cm×2cm),以0.5mol/L pH7.4 PBS液洗脫,流速10ml/h。

    (9) 測(cè)OD403nm,集SPA-HRP活性部分。

    (10) 將高活性組分合并,加入甘油(含30%)置低溫保存。也可以采用過(guò)碘酸鈉法,制法如下:①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中;②加入無(wú)水乙醇配制1%1-熒光-2,4二硝基苯0.1ml,室溫混合1h;③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸餾水配制)室溫中混合30min;④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸餾水配制),室溫緩慢混合1h;⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3緩沖液于4℃透析過(guò)夜;⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室溫緩慢混合3h即可。

    (11) SPA-HRP活性測(cè)定:①取豬血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反應(yīng)板,4℃過(guò)夜,3×3min沖洗;②加入適量稀釋的SPA-HRP溶液0.1ml,置37℃2h,沖洗3×3min;③加入底物顯色,顯色的深淺應(yīng)與SPA-HRP的活性成正比。

    2.稀釋液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。

    3.包被液 pH9.6碳酸鹽緩沖液。

    4.洗滌液 0.02Mol/L7.4Tris-HCl緩沖液。

    5.底物溶液 pH 5.6磷酸鹽-檸檬酸緩沖液:

    0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml

    0.1mol/L 檸檬酸(19.20g/L) 24.30ml

    H2O 50.00ml

    用前加40mg鄰苯二胺,溶解后加30%H2O20.15ml。

    6.終止液 2mol/L H2SO4 1滴。


    操作方法

    1.檢測(cè)抗體

    ⑴ 包被:用pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成50μg-100μg/ml,每孔加0.1ml,37℃感作2h后置4℃過(guò)夜。

    ⑵ 洗滌:以pH 7.4 Tris-HCl液洗滌3×3min。

    ⑶ 加樣:用pH 7.4PBS-Tween液稀釋被檢樣品,每孔0.1ml,37℃感作2h。

    ⑷ 洗滌3×3min。

    ⑸ 加SPA SPA經(jīng)pH7.4 PBS-Tween液稀釋后,每孔加入0.1ml,37℃30min。

    ⑹ 洗滌3×3min。

    ⑺ 加底物:每孔加底物0.1ml,置室溫15min(避光),再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)終止反應(yīng)。

    2.檢測(cè)抗原

    ⑴ 包被:以抗體包被,此抗體必須用SPA不能結(jié)合的那些動(dòng)物的lgG,否則會(huì)因?yàn)镾PA同包被抗體結(jié)合而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,包被條件同上。

    ⑵ 洗滌。

    ⑶ 加樣。

    ⑷ 洗滌。

    ⑸ 加抗體:此抗體必須選用能與SPA結(jié)合的動(dòng)物IgG,否則可因?yàn)镾PA不能同此層抗體結(jié)合而發(fā)生假陰性結(jié)果。

    ⑹ 洗滌。

    ⑺ 加SPA。

    ⑻ 洗滌。

    ⑼ 加底物及終止反應(yīng)。

    3.檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原

    ⑴ 蓋玻片培養(yǎng)單層細(xì)胞。

    ⑵ 接種易感病毒。

    ⑶ 用甲醇固定細(xì)胞。

    ⑷ 加抗血清于蓋玻片上,37℃孵育1h。Tris-HCl液3×3min洗滌。

    ⑸ 將PPA滴加在蓋玻片上,37℃孵育30min。

    ⑹ 洗滌3×3min。

    ⑺ 將蓋玻片置底物溶液中,室溫15min。

    ⑻ 以pH7.4 Tris-HCl液稍加沖洗后即可鏡檢。


    結(jié)果判定

    1.檢測(cè)抗體或抗原

    ⑴ 眼觀(guān)判定:在對(duì)照組成立的前提下,和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性孔相近顏色者,均判為陽(yáng)性(+)。

    ⑵ 酶標(biāo)儀測(cè)定:以空白對(duì)照孔調(diào)零,標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品校正至某一規(guī)定值,測(cè)定待測(cè)孔,當(dāng)待測(cè)孔OD值或計(jì)算值達(dá)某一規(guī)定閾值時(shí),判為陽(yáng)性。

    2.檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原 鏡下觀(guān)察,凡細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者,判為陽(yáng)性。


    注意事項(xiàng)

    1.目前使用的聚苯乙烯塑料板對(duì)抗體的吸附性能較好,,因此對(duì)于抗原,特別是大分子(分子量>100萬(wàn))的抗原應(yīng)該進(jìn)行一些適當(dāng)?shù)奶幚?如DNA,應(yīng)將其事先凍融,使其變成較小分子再包被,如脂蛋白則應(yīng)改變包被的溫度,可在37℃包被過(guò)夜。

    2.由于SPA-ELISA的敏感性極高,因此也很容易出現(xiàn)非特異性顯色,排除非特異性顯色的方法除了純化抗原抗體外,還應(yīng)該注意:

    ⑴抗原包被后,再以牛血清白蛋白包被一次或稀釋液中加入1%的牛血清白蛋白均可,以占據(jù)未包被的一些空隙。

    ⑵檢測(cè)血清抗體時(shí),需事先檢測(cè)大標(biāo)本量的正常血清效價(jià)水平,在檢測(cè)待檢標(biāo)本時(shí),減去正常的血清效價(jià)。

    ⑶ELISA法加入標(biāo)記物后往往37℃孵育2h,SPA同IgG的結(jié)合不是免疫反應(yīng),而是一種化學(xué)反應(yīng),一般認(rèn)為,這種結(jié)合可能在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生,所以加PPA后,孵育時(shí)間可以縮短到0.5h。孵育過(guò)久,反而可因?yàn)镾PA本身吸附到反應(yīng)板上,造成非特異性顯色。

    3.疊氮鈉對(duì)SPA顯色影響較大,所以在SPA-ELISA過(guò)程中,不宜加疊氮鈉做防腐劑,在組織細(xì)胞培養(yǎng)固定,也不適宜用甲醛固定,而需采取甲醇或乙醇。

     

     

     
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