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    單克隆抗體的細胞融合過程

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27
    融合的方法很多,常用的有轉(zhuǎn)動法和離心法。
    融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。
    1.試劑與材料
    (1) 供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
    (2) 1640培養(yǎng)液100ml。
    (3) 完全1640液100ml。
    (4) 2.5%FCS-1640液50ml。
    (5) HAT培養(yǎng)液100ml。
    (6) 50%PEG:取分子量4 000,高純度的(日本進口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調(diào)pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調(diào)整。
    (7) 10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。
    (8) 40孔塑料培養(yǎng)盤。
    2.操作方法
    ⑴ 準備好脾細胞。
    ⑵ 在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞,并加入50ml 2.5%FCS-1640液。
    ⑶ 室溫400g離心3min,使細胞沉淀。
    ⑷ 移去上清液。
    ⑸ 輕敲管底部,使沉淀流動,把沉淀管放于40℃水浴中,使其達融合溫度。
    ⑹ 加預熱至40℃的50%PEG 0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn),滴加過程要求持續(xù)2min。
    ⑺ 加1ml1640液,邊加邊搖動,持續(xù)1min。
    ⑻重復⑺一次。
    ⑼ 加1ml 1640液,邊加邊搖動,持續(xù)0.5min。
    ⑽ 重復⑼一次。
    ⑾ 加1640液15ml。
    ⑿ 室溫,400g離心1min,使細胞沉淀。
    ⒀去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。
    ⒁ 往已于前一日種有飼養(yǎng)細胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細胞液,每孔1滴(約0.05ml)。
    ⒂ 輕搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
    ⒃ 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細胞吸出,根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細胞。
    ⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn),但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細胞出現(xiàn)后,吸取上清液,檢查抗體。
    ⒅ 對繼續(xù)生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中,依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10黃-1640液。同時保存于液氮和進行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產(chǎn)生抗體細胞的變異和丟失。
     

     

     
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