免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等),也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實(shí)驗(yàn)動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體,常可獲得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時,則需同時加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此,如欲獲得高特異性的免疫血清,必須予先純化抗原。此外,抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等,也是影響免疫血清效價的重要因素應(yīng)予重視。
一、原理
具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識別,因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體,實(shí)際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外,抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性,牨m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
二、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。
1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛,以酒精及碘酒消毒皮膚;
2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml,每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
3. 第二次免疫:間隔10-14天后,于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG,每個淋巴結(jié)注0.1ml,其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時,直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
4. 間隔7-10天后,從耳靜脈采血0.5~1.0ml,分離血清,以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時才能放血。
5. 若效價未達(dá)到要求,可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次,分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后,以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次,再試血測抗體效價,如效價達(dá)到要求立即放血。
三、放血
(一) 心臟采用血法
1. 家兔仰面,四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定);
2. 剪去左胸部兔毛,消毒皮膚;
3. 用左姆指摸到胸骨劍突處,食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟,并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后,以左拇指觸摸心臟搏動最強(qiáng)的部位;
4. 用50ml注射器(連接16號針頭),傾針45°角度,對準(zhǔn)心搏最強(qiáng)處刺入心臟抽血致死;
5. 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中,待凝固后分離血清。
(二) 頸動脈放血法
1. 家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚;
2. 沿頸部中線切開皮膚約10cm,分離皮下組織,直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突;
3. 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織,暴露出頸總動脈后使之游離;
4. 于動脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾;
5. 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口,插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上,以防放血管滑脫;
6. 松開血管夾,使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。
四、分離血清
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時,再置4℃冰箱內(nèi)3~4小時。待血液凝固血塊收縮后,用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘,取上清加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉,最終濃度),分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
五、結(jié)果鑒定
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定所獲免疫血清的抗體效價,并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量,應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。
六、材料
(一) 動物:健康成年家兔,雄性,體重2~3公斤。
(二) 器材:剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號、6號)、稱量瓶(10ml)、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。
(三) 試劑
1. 滅菌生理鹽水;
2. 純化人IgG(10mg/ml);
3. 消毒酒精及碘酒;
4. 羊毛脂;
5. 石蠟油;
6. 活卡價苗(BCG)(75mg/ml);
7. 弗氏不完全佐劑(FIA)制備:稱羊毛脂10克,逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油40ml,邊滴邊研磨,分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml),高壓滅菌(8磅20分鐘)后保存?zhèn)溆谩?/p>
8. 弗氏完全佐劑乳化抗原(FCA-IgG)的制備:將FIA予溫(60℃30分鐘),吸取3ml于研缽中,逐滴加入活BCG(75mg/ml)0.5ml及純化人IgG2.5ml(2.4mg/ml)牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液,取1滴滴于冷水面上不散開為合格。
七、注意事項(xiàng)
1. 免疫用實(shí)驗(yàn)動物的抗體反應(yīng)性個體差異性較大,因此免疫時至少應(yīng)選用兩只以上動物。另外,不能使用妊娠動物。
2. 免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射,否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時、費(fèi)力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)/分,振幅6mm);后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后,吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。
3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價的免疫血清,但若抗原不純時,可使抗原中極微量的污染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體,以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外,有些實(shí)驗(yàn)動物種系對BCG過敏,尤其是豚鼠其次是家兔,當(dāng)再次注射完全佐劑時,可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此,第二次免疫注射時應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不完全佐劑,以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4. 抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少,免疫原性弱的抗原劑量可相對較多?乖挠昧恳话阋泽w重計算。在使用佐劑的情況下,一次注入的總劑量以0.5mg/kg體重為宜。如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外,免疫周期長者可少量多次注射,免疫周期短者可較大量少次注射。
5. 免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射,同時于兩側(cè)肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注0.2ml,間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射,也可產(chǎn)生高效價的免疫血清。