雙向電泳IEF (sigma)IEF(not IPG)/SDS-PAGE最簡單的裝備推薦如下,適合于沒多少money做IPG又想做“熱”的所謂蛋白質(zhì)組的.
IEF用Biorad的圓盤電泳槽(不行用國產(chǎn)的吧,不推薦),SDS-PAGE用六一廠的就可以了(ft,六一廠應(yīng)該給我money吧,給你做廣告了)(money不是很多的強(qiáng)烈推薦六一的,買進(jìn)口電泳槽的錢留出來測搞出的差異蛋白質(zhì)的序列吧,呵呵)
BIO-RAD 的圓盤電泳槽,國產(chǎn)的不推薦,因?yàn)?上槽 Biorad 的鉑金絲凹進(jìn)去了一點(diǎn),不是很進(jìn)去,而國產(chǎn)的凹得太進(jìn)去了以至于電聚焦時(shí)產(chǎn)生的氣泡繞在鉑金絲一圈,影響電聚焦.
雙向電泳
1.蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal 等(1986)的方法進(jìn)行.100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM 即0.07%β- 巰基乙醇),混勻,-20℃沉淀1 小時(shí),4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再于-20℃沉淀1小時(shí),同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干.
按每mg干粉加入20μl(可調(diào))UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃育30min,期間攪動(dòng)幾次,28度 (溫度低,高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時(shí)間長一點(diǎn)越好!上清即可上樣電泳.或者-70度保存
2 蛋白質(zhì)濃度測定
按Garrels(1983)的程序,稍加改動(dòng).10μl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min離心15min,棄上清,再加入100μl冷丙酮,同上離心5min,棄上清,凍干沉淀,用100μl PBS溶液復(fù)溶,并按Bradford(1976)的程序測定蛋白質(zhì)濃度.說實(shí)話,好象Bradford法不太好做
2.3.1 電聚焦(IEF)
2.3.1.1 玻管準(zhǔn)備
干凈玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm處作好標(biāo)記,垂直放在泡沫板上.電聚焦的管子,買原裝的也可以,實(shí)在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,內(nèi)徑1.5mm左右的,長度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的;玻璃管的處理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自來水沖后;用雙蒸水沖,用雙蒸水泡至少1hr,中間至少換2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 個(gè)小時(shí),用雙蒸水沖,(不能用自來水沖),然后雙蒸水泡至少1 個(gè)小時(shí),中間換3,4 次水,可多泡一會(huì).最后泡在無水乙醇里面1hr,轟干就可以用了.
2.3.1.2 凝膠制備與電聚焦
灌IEF的配方為
3.09克尿素
1.125 ml 10%NP-40
1.125ml 水
0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 (ACR 28.38 BIS 1.62)
0.15 ml Am 3.5-10
0.375ml Am 5-7
8微升 10%AP
1.8微升TEMED
用注射器吸好膠液,裝上7號(hào)針頭,將7號(hào)針頭插入玻管底部,邊推注射器邊提針頭,直到標(biāo)記處,用微量進(jìn)樣器小心加入少量水,可見明顯的界面出現(xiàn),讓其聚合1小時(shí)以上,適當(dāng)長一點(diǎn)的時(shí)間好一些,我一般是頭天下午灌膠,第2 天下午才開始跑電泳.待膠聚合好后,除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液,加樣80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破壞樣品與NaOH 的界面.即可進(jìn)行電泳.電極液為:上槽(負(fù)極)為50m mol/L NaOH 液,下槽(正極)為25m mol/L H3PO4.按 200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序進(jìn)行電聚焦.或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特別是冬天,我的方法是 溫控儀控制 暖風(fēng)機(jī) 在37 度暖風(fēng)機(jī)和電泳槽在一個(gè)大的紙箱(密封)里.呵呵,應(yīng)該可以想象得到吧,第一向溫度特別重要,不然,電聚焦肯定做不好.
2.3.1.3 電泳后的凝條處理
電聚焦完畢后,用注射器吸滿水,套上一個(gè)200μl的槍頭,當(dāng)然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣.從頂部向下注水使膠條向下滑出.當(dāng)然,剛開始做的時(shí)候肯定不熟,很不爽,有時(shí)候你會(huì)唱 想哭卻又哭不出來,呵呵,熟悉了就快了,注射器 槍頭玻璃管必須為一直線,消息不要把注射器的頭搞斷了.取一膠條,用雙蒸水洗凈兩端,按酸端到堿端的順序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜,次日用酸度計(jì)分別測定各段的pH值,以凝膠長度為橫坐標(biāo),pH值為縱坐標(biāo)作圖,即為等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線.漫漫擠,管子,200 衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,,要用一手扶著管子,一手拿住200 衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來,注射器頂在胸前把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么時(shí)候跑SDS-PAGE就什么時(shí)候跑.絕招哦,不要隨便亂傳,嘿嘿!還可以馬上看一下,膠條上有蛋白質(zhì)沒有,有的話一下就可以看見了.那些說什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵!就跟你用考染IEF 膠條一樣的,帶,可能先在12%的TCA 里面看不見,不過你再把它放在水里面,泡一會(huì)帶就出來了.不過在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5 次水,每次用不同的小平皿.
注意到下級(jí)液 磷酸 部分的膠條沒,是不是有一節(jié)約2cm左右,比較突出,沒有膨大的部分呀!只是在tca泡的時(shí)候磷酸段有一小截變白的速度比較慢,大約3cm左右,呵呵!
對(duì)要進(jìn)行第二向SDS-PAGE 的膠條則必須用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL(pH6.8),10%甘油,5%β-巰基乙醇,0.1%溴酚藍(lán)]進(jìn)行二次平衡,第一次20min,第二次25min.第2 次的溶液為新的.一般我是把第2次用過的當(dāng)成第一次的用 .平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿.
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
選用DYY-Ⅲ型(北京六一儀器廠生產(chǎn))電泳槽(規(guī)格為200×200×1mm),分離膠濃度為12%,無濃縮膠.待膠聚合后,將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端(避免膠條拉直),并用1%瓊脂糖(電極緩沖液配制)封膠,特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮.61 廠板子之灌膠:堅(jiān)決不用凡士林,用透明膠將兩端(板子的2 邊)封住,再用2%瓊脂之SDS-PAGE 電極液封底,待瓊脂凝固后再灌膠,最后用水封膠.over!
做之前,一定要保證,1,灌膠不會(huì)有任何問題,不能漏,2,不用濃縮膠,只用分離膠.3,分離膠用水封,要保證凝聚好的PAGE 膠,為一平的線,凹來凸去的就不要用了.玻璃版能用硅化劑最好不過了.防止從邊上漏,我用透明膠(約4cm寬),封住兩邊,下面還是用2%的瓊脂封.灌好電極緩沖液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板膠恒流進(jìn)行電泳,待溴酚蘭離底部1cm時(shí)即可停止電泳,一般電泳耗時(shí)約4-5h.銀染:凝膠于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者過夜;用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min;水洗6×5min; 0.02%硫代硫酸鈉1min;水洗3×20s;0.2%硝酸銀,0.02%甲醛快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;0.2%硝酸銀,0.02%甲醛20min;水洗3×20s;顯色液(3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉)快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個(gè)溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;顯色液(3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉)顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點(diǎn)又多的話就可以了;水洗20秒;0.05%甘氨酸停顯.染色理想溫度:我去年4,5月時(shí),通常染色都定在中午,12點(diǎn)多;溫度最好是20 度左右,(這個(gè)溫度我也沒控制的)100%TCA領(lǐng)一瓶TCA 500g的那種 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME 丙酮 (100ml):
100%TCA 10ml
2-ME 0.07ml
丙酮 90ml
0.07%2-ME 丙酮 (100ml):
2-ME 0.07ml
丙酮 100ml
0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)50ml
Urea 28.5g
NP-40 1ml
Ampholine 5~7 2.0ml
3.5~10 0.5ml
2-ME 2.5ml
注意定容!配好后用1.5ml 管分裝!-70度保存
注意 這兩個(gè)溶液 配的時(shí)候 比如配 50ml 用100ml的燒杯 用量筒量50ml 水 倒如燒杯里面,用記號(hào)筆標(biāo)上刻度,然后把水倒掉,再稱 尿素 小量加水,因?yàn)槟蛩丶铀篌w積會(huì)變大,再37 度水域鍋里溶,然后加其它成分,最后再定到50ml
UKS液 (含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)
25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
2-ME
Ampholine(3.5~10)1.25ml 2.5ml
Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 槍,4槍)
2-ME 可適當(dāng)加一些!注意定容!配好后用1.5ml管分裝!-70度保存!
雙向電泳IPG(summer)
一、樣品提。喝却姿—丙酮沉淀法
(1)在液氮中研磨葉片
(2)加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1 小時(shí))棄上清.
(3)加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí)),然后真空干燥沉淀,備用.
(4)上樣前加入裂解液,室溫放置30 分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)),可臨時(shí)保存在4℃待用.
(5)用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?
二、一向電泳(13cm的holder)
(1)取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達(dá)到250vl
(2)將上述溶液加到holder 的兩個(gè)電極之間.
(3)去掉膠條的保護(hù)膜,膠面朝下,先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,慢慢下壓膠條,并前后移動(dòng),避免生成氣泡,最后放下膠條平端,使溶液浸濕整個(gè)膠條.
(4)在膠條上覆蓋適量的覆蓋油,蓋上蓋子.
(5)將膠條槽平放于一向儀器上,與水平方向垂直.
(6)設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù):
三、膠條的平衡(由一向到二向)
(1)將膠條放入10ml 平衡緩沖液中(加入10mgDTT)封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.
(2)將膠條取出放入10ml 新的平衡緩沖液中(加入250mg 的碘乙酰胺)封口,在振蕩儀上振蕩15 分鐘.
(3)用去離子水潤洗膠條一秒鐘,將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘,以去除多余的平衡緩沖液.
四、二向電泳
(1)將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上,然后用瓊脂糖封頂,準(zhǔn)備第二向電泳.
(2)設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù):
五、平板膠的染色
硝酸銀染色:(整個(gè)操作在搖床上進(jìn)行)
(1)固定:25ml的冰醋酸,100ml甲醇,125ml 去離子水,60 分鐘.
(2)敏化:75ml甲醇,0.5g硫代硫酸鈉(使用之前加入),17g醋酸鈉,165ml去離子水,30分鐘.
(3)清洗:用250ml 的去離子水清洗3 次每次5 分鐘.
(4)銀染:0.625g硝酸銀,250去離子水,(使用之前配制)20 分鐘.
(5)顯色:6.25g碳酸鈉,100vl 的甲醛(使用之前加入),250ml 去離子水.
(6)終止:5%的醋酸.
(7)照相分析.
(8)保存制作干膠.
藥品:
提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M 的DTT65μl/ml.
平衡緩沖液:1.5MTris-Cl ph8.8 6.7ml,尿素72.07g ,87%的甘油69ml,SDS 4g,溴酚藍(lán)少許.溶漲液:尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚藍(lán)少許溶于無菌水中,總體積為25ml.使用之前再加入IPG緩沖液 0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl.
制作平板膠:
分離膠的配制方法:
藥品/濃度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%
丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml
分離膠緩沖液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml
10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
無菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml
10%過硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl
TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl
*在灌膠之前加入
藥品配制:
丙烯酰胺單體儲(chǔ)液:丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml分離膠緩沖液:Trisbase181.5g 溶于750ml 無菌水中調(diào)pH8.8總體積1000ml10%SDS:SDS5g溶于無菌水中總體積50ml10%的過硫酸胺:0.1g溶于無菌水中總體積1mlSDS 電泳緩沖液:Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于無菌水中總體積5000ml
封膠溶液:SDS電泳緩沖液100ml 瓊脂糖0.5g溴酚藍(lán)少許附:蛋白質(zhì)含量測定的方法(Bradford 方法)
原理:這一方法基于2 考馬斯亮藍(lán)G-250 有紅藍(lán)兩種不同的形式.在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,產(chǎn)生藍(lán)色化合物,反應(yīng)迅速而穩(wěn)定.反應(yīng)化合物在 465-595nm處有最大的光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系,因此可檢測595nm的光吸收值的大小計(jì)算蛋白的含量.
溶液:
1)Bradford儲(chǔ)存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG藍(lán)
室溫下長期保持穩(wěn)定.
2)Bradford工作液
425ml雙蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford儲(chǔ)存液
用濾紙過濾,保存于室溫棕色瓶中,可保存數(shù)周,但在使用前需要過濾.
3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)
做標(biāo)準(zhǔn)曲線:取樣品即可測量.
注意事項(xiàng):
1、樣品的問題:
樣品制備是做好2-d 的關(guān)鍵,這句話好象有點(diǎn)多余,如果樣品中離子濃度過大,根本做不了2d,我開始的時(shí)候由于提取方法有問題,結(jié)果浪費(fèi)了很多時(shí)間和IPG膠條,真的很心痛呀!另外再說明一點(diǎn),最好用新鮮的樣品提取蛋白質(zhì),蛋白點(diǎn)的差異很大,新鮮的樣品點(diǎn)多,而我用存放在-80 的樣品跑出來效果差了很多呀!如果你不確定你的蛋白提的如何,建議你先跑sds-page.檢驗(yàn)一下.關(guān)于蛋白的提取方法,我還想聽聽各位的建議.
2、上樣量的問題,我覺得我跑的這張2D 圖,上樣量還需要調(diào)整,可以適當(dāng)降低,我的ipg 膠條是13 厘米的上樣量在50ng-80ng之間,上樣量不合適,豐度低的將會(huì)被豐度高的所遮蓋,這是最討厭的問題.
3、跑一向的時(shí)候大家都差不多,根據(jù)公司的說明就可以做了.跑二向的時(shí)候我現(xiàn)在一般做恒壓,以前做過恒流,沒感覺有什么差異,還想請教各位!橫流和恒壓到底哪個(gè)更好一些!
4、ipg 膠條ph 的選擇,我做的是植物的花藥,一般情況下酸性端點(diǎn)多一點(diǎn),堿性端較少,我現(xiàn)在選用的是ph3-10 的,我覺得很不合適,(不過這個(gè)膠條是免費(fèi)的)因此好多點(diǎn)沒能很好的分開,如果膠條的ph小一點(diǎn),膠條(我希望能達(dá)到18cm)可是我們這里做不了,效果應(yīng)該比這個(gè)好很多的!
5、從這塊膠上,我覺得致命點(diǎn)就是背景深,將影響我下一步的分析.所以銀染還需要改進(jìn)!
6、針對(duì)不同的蛋白質(zhì),分離膠的濃度也是可以調(diào)節(jié)的,我比較懶,就作過10%,12.5%的,不過覺得都不適合.