隨著蛋白質(zhì)研究變得更加復雜,定量方法開始發(fā)展。 1976年,布拉德福德分析是在天然溶液中研究更多蛋白質(zhì)并使用清潔劑或其他還原劑來保持蛋白質(zhì)可溶性的墊腳石。然后將Lowry試驗再培養(yǎng)至二辛可寧酸(BCA)測定(也稱為Smith測定),這使其更適合用于蛋白質(zhì)研究的溶劑中。
然而,蛋白質(zhì)定量的最新創(chuàng)新已存在超過25年。小編將概述當前的蛋白質(zhì)檢測和定量方法,并討論一種新的基于紅外的技術(shù),用于快速準確地測量痕量蛋白質(zhì)。
當前現(xiàn)狀
用于蛋白質(zhì)和/或肽測定的一些最常用的方法包括氨基酸分析,紫外(UV)光譜,比色測定,十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和光密度測定,基于免疫學的方法和質(zhì)譜法。
氨基酸分析
氨基酸分析測量蛋白質(zhì)中每種氨基酸的量,并被認為是蛋白質(zhì)定量的黃金標準方法。該方法可以檢測大多數(shù)氨基酸,檢測范圍為1 mg苯基硫代氨基甲;≒TC)和5 mg至10 mg茚三酮。該方法不像其他測定那樣廣泛使用,因為它昂貴,緩慢且需要技術(shù)專業(yè)知識。因此,氨基酸分析實驗室經(jīng)常被用作核心設施。
紫外光譜法
紫外光譜法測量樣品中芳香族氨基酸的吸光度,是用于蛋白質(zhì)檢測和定量的最常用方法。可以測量任何類型的蛋白質(zhì),范圍從205nm處的1mg至100mg和280nm處的20mg至1,000mg。紫外分光光度計相對便宜且易于使用。
比色分析法
通過顯色試劑測定蛋白質(zhì)濃度的比色測定。最常見的比色測定是染料結(jié)合和熒光方法。熒光方法包括NanoOrange試劑盒(在570nm處10ng至10mg)和CBQCA(在550nm處10ng至150mg),其通常比染料結(jié)合方法更敏感,包括Bradford(1mg至50mg)和Bicinchoninic。 。酸(BCA; 0.2)。鎂至50毫克)。
大多數(shù)蛋白質(zhì)測定對溶劑條件敏感。有關(guān)套件和緩沖組件的更多信息,請訪問制造商的網(wǎng)站。該信息使研究人員能夠使用蛋白質(zhì)沉淀或小規(guī)模凝膠過濾去除潛在的干擾物質(zhì)。
SDS-PAGE和密度測定法
SDS是一種陰離子洗滌劑,可使蛋白質(zhì)線性化并用負電荷覆蓋它們。然后在電泳期間通過大小分離蛋白質(zhì),并且可以使用定量光密度測定法測量蛋白質(zhì)。對于銀染色,SDS-PAGE蛋白質(zhì)測定范圍為每條1ng至5ng,對于考馬斯藍,SDS-PAGE蛋白質(zhì)測定范圍為每條40ng至50ng。
基于免疫學的方法
例如定量酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),Western印跡和斑點印跡,是用于蛋白質(zhì)檢測和測量的非常常見且靈敏的測定,其依賴于使用抗體進行蛋白質(zhì)捕獲。這些方法中使用的抗體針對構(gòu)象和線性表位。對于蛋白質(zhì)印跡,重要的是使用針對肽或變性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體,因為SDS使抗原變性。
質(zhì)譜法
質(zhì)譜法通常用于功能蛋白質(zhì)組學,以測量復雜生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)豐度的微小變化,以響應疾病進展或藥物治療等干擾。然而,質(zhì)譜法可能昂貴且緩慢,并且需要專業(yè)知識來運行儀器。此外,質(zhì)譜儀可能無法完全量化。
新穎的檢測方法
EMD Millipore提供基于直接檢測傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀的新蛋白質(zhì)/肽定量方法。該系統(tǒng)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)鏈中的酰胺鍵進行高精度紅外(IR)測量,而不依賴于氨基酸組成,染料結(jié)合特性或氧化還原電位。
蛋白質(zhì)在IR光譜中由9個酰胺峰表示,并代表肽鍵的不同振動模式。特別是,酰胺I和酰胺II鍵的獨特之處在于即使在復雜的混合物,還原劑和洗滌劑存在下它們的信號強度和純度也是相同的。因此,這些頻帶用于測量。該系統(tǒng)的準確性與氨基酸分析的準確性相當
直接檢測系統(tǒng)包括蛋白質(zhì)檢測技術(shù)和分析工具,包括預先安裝在軟件上的BSA標準曲線。該測定僅需要2微升樣品,沉積在無測定卡上,置于儀器中然后測量。整個過程大約需要兩到三分鐘。
蛋白質(zhì)檢測和定量是藥物開發(fā)過程的關(guān)鍵組成部分。有多種方法可供選擇,每種方法都有自己的優(yōu)勢和挑戰(zhàn),并且在為每種應用選擇最佳方法時需要考慮許多因素。
蛋白質(zhì)定量技術(shù)已經(jīng)使用了半個多世紀,但該領(lǐng)域相對停滯了超過25年。開發(fā)新工具對于為研究人員提供快速,易用的蛋白質(zhì)檢測和定量方法至關(guān)重要。