1.從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液（I）（不含DTT,不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管）,置室溫溶解.

2.在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻.

3.從小管中取出400ml水化上樣緩沖液,加入100ml樣品,充分混勻.

4.從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7）,室溫中放置10分鐘.

5.沿著聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中槽的邊緣至左而右線性加入樣品.在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液一定要連貫.注意：不要產(chǎn)生氣泡.否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布.

6.當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中后,用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層.

7.分清膠條的正負(fù)極,輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤(pán)或水化盤(pán)中樣品溶液上,使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤(pán)的正極.確保膠條與電極緊密接觸.不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上,因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收.同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡.如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的一端,上下移動(dòng)膠條,直到氣泡被趕到膠條以外.

8.在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油,防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā).需緩慢的加入礦物油,沿著膠條,使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上.

9.對(duì)好正、負(fù)極,蓋上蓋子.設(shè)置等電聚焦程序.

10.聚焦結(jié)束的膠條.立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置于樣品水化盤(pán)中,-20℃冰箱保存.

（二）第二向SDS-PAGE電泳

1.配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊.配80ml凝膠溶液,每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板夾層中,上部留1cm的空間,用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面,保持膠面平整.聚合30分鐘.一般凝膠與上方液體分層后,表明凝膠已基本聚合.

2.待凝膠凝固后,倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇,用MilliQ水沖洗.

3.從-20℃冰箱中取出的膠條,先于室溫放置10分鐘,使其溶解.

4.配制膠條平衡緩沖液I.

5．在桌上先放置干的厚濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上.將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多余水分,然后直接置于膠條上,輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品.這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋.

6.將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤(pán)中,每個(gè)槽一根膠條,在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I.將樣品水化盤(pán)放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘.

7.配制膠條平衡緩沖液II.

8.第一次平衡結(jié)束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液I.并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面）.再加入膠條平衡緩沖液II,繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘.

9.用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體.將處理好的第二向凝膠放在桌面上,長(zhǎng)玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝膠的頂慷宰拋約骸?br>

10.將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解.

11.將10×電泳緩沖液,用量筒稀釋10倍,成1×電泳緩沖液.趕去緩沖液表面的氣泡.

12.第二次平衡結(jié)束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤(pán)中的膠條平衡緩沖液II.并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面）.

13.將IPG膠條從樣品水化盤(pán)中移出,用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中.然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上.其余膠條同樣操作.

14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上,短玻璃板一面對(duì)著自己.在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液.

15.用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸.注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡.在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí),要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜,不要碰到膠面.

16.放置5分鐘,使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固.

17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后.將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中.

18.在電泳槽加入電泳緩沖液后,接通電源,起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成一條線后,再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm）,待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳.

19.電泳結(jié)束后,輕輕撬開(kāi)兩層玻璃,取出凝膠,并切角以作記號(hào)（戴手套,防止污染膠面）.

20.進(jìn)行染色.