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    質(zhì)譜系列—質(zhì)譜是如何做到定量的?

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-07-07
    核心提示:  質(zhì)譜信號的強(qiáng)度=粒子總數(shù) x 離子化效率(就是你說的離子化難易程度)
     質(zhì)譜信號的強(qiáng)度=粒子總數(shù) x 離子化效率(就是你說的離子化難易程度)

    引言

    采用一系列方法測定或者至少能夠固定(以LCMSMS為例,就是優(yōu)化電壓,噴霧角度,流動相組成比例,三氣的流量,基質(zhì)的組成全部固定下來)特定方式下的離子化效率,質(zhì)譜是可以用于定量的。

     

    舉個例子,調(diào)諧好系統(tǒng)之后,你噴入1ppb的利血平溶液,得到的信號為一萬;再噴入10ppb的利血平得到的信號為十萬。然后你噴入δ知濃度的利血平,發(fā)現(xiàn)其信號值為五萬,你就可以認(rèn)為δ知濃度的利血平為5ppb。

     

    質(zhì)譜的定量和紫外檢測器,蒸發(fā)光檢測器û什ô本質(zhì)區(qū)別,只不過質(zhì)譜的線性范Χ比較令人抓狂而已。當(dāng)然還有一系列的問題,比如說特別是很多生物分析的樣品,你稀釋十倍之后很可能質(zhì)譜信號的強(qiáng)度不會下降十倍。1ppm對應(yīng)的離子計數(shù)為一萬,0.1ppm對應(yīng)的離子計數(shù)不是一千而很可能是五千三千。

     

    任何物理量的定量過程都無非是和“尺子”去對比,質(zhì)譜分析當(dāng)然也不例外。要實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜定量分析一般有兩種方法。

     

    1外標(biāo)法


    將待測物質(zhì)A的標(biāo)準(zhǔn)品(特點(diǎn)是純度非常高,有時也可稱之為該物質(zhì)的純品)用某種有機(jī)溶劑S稀釋成不同的濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取等量(一般是等體積)的這些不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。由此可以得到一組樣品量和信號值一一對應(yīng)的數(shù)據(jù),以其繪制成的曲線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線,F(xiàn)在就有了一把還不錯的尺子,然后就可以去拿要檢測的實(shí)際樣品R進(jìn)行質(zhì)譜分析了。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以由得到的信號值去反推物質(zhì)A在該實(shí)際樣品R中的含量了。

     

    2內(nèi)標(biāo)法

     

    將已知量待測物質(zhì)A的同λ素標(biāo)記物I摻雜到實(shí)際樣品中去,然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。同λ素標(biāo)記物一般是利用H原子的同λ素氘,即A里面的H在其同λ素里都換成了氘,這樣通過A的化學(xué)式就能推算出,A和I的質(zhì)譜峰的差別也就知道了。根據(jù)兩者信號的比值和I的實(shí)際摻雜量就能推算出A的質(zhì)量。為什ô選擇同λ素標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)定呢?原因就是因?yàn)閮烧咧g的各種物理和化學(xué)屬性非常接近,除了分子量的差別幾乎可以認(rèn)為一模一樣,因此就可以排除由于樣品中基質(zhì)的干擾(離子抑制之類的)引起的誤差。值得一提的是這種情況在外標(biāo)法里是無法避免的。

     

    當(dāng)然實(shí)際上為了簡化流程或者實(shí)在是不好找同λ素標(biāo)記物(實(shí)際上有大量的同λ素標(biāo)記物可以買到),或者節(jié)省成本以及其他原因,往往采用其他不是同λ素的物質(zhì)做標(biāo)記物,當(dāng)然標(biāo)準(zhǔn)還是要往物性相似上去貼的。這樣做出的定量結(jié)果,在一定程度上也是可以接受的。

     

    按理說保持完整性還得分析個優(yōu)缺點(diǎn),不過今天不想分析了,不能為了科普不干正事了。真是這一行的各λ,直接去找本教材看看吧,都是常識。

     

    質(zhì)譜信號強(qiáng)度與待分析物含量的關(guān)系

    任何定量分析方法都需要建立實(shí)驗(yàn)測量信號與待分析物的量的關(guān)系。很幸運(yùn)的是,在質(zhì)譜中,通常也可以建立這樣的關(guān)系,因此質(zhì)譜信號是可以用于定量的。


    既然問題是“質(zhì)譜是怎樣做到定量的?”,我們不妨把質(zhì)譜信號的產(chǎn)生按時間順序粗略分為三個步驟,即離子的產(chǎn)生,傳輸與檢測。

     

    產(chǎn)生離子時,不同樣品分子的電離通常是相互獨(dú)立的。因此樣品量越多,其產(chǎn)生的離子也就越多。目前常用的各種離子化方法(EI、ICP、ESI、MALDI等)在實(shí)驗(yàn)中(嚴(yán)格來說僅在一定濃度范Χ內(nèi)——術(shù)語是動態(tài)范Χ,dynamic range)都至少滿足樣品量與產(chǎn)生離子量的正相關(guān),一般情況下也可以進(jìn)一步近似成線性相關(guān)。

     

    傳輸離子時,簡單來說可以認(rèn)為傳輸效率與被傳輸離子的量無關(guān);(嚴(yán)格地說,被傳輸?shù)碾x子太多時,相同電荷的互相排斥會造成離子束的“體積”變大,導(dǎo)致傳輸效率下降。這種影響在空間有限的離子阱中表現(xiàn)得更加明顯,因此在離子阱質(zhì)譜中一個重要的技術(shù)就是適當(dāng)控制進(jìn)入儀器的離子數(shù)量,使其既不太少也不太多。)

     

    檢測離子時,不論是使用光電倍增管的檢測器,還是檢測鏡像電流的檢測器(ICR/Oribtrap),其信號強(qiáng)度(在一定范Χ內(nèi))均與離子數(shù)量大致線性相關(guān)。

     

    廢話幾句,可能會使大家感覺質(zhì)譜不能定量的原因之一是,我們看到的質(zhì)譜圖常用相對強(qiáng)度作為縱坐標(biāo),即0-100%最強(qiáng)峰,而不展示信號的絕對強(qiáng)度。但在做質(zhì)譜的時候,儀器記¼的當(dāng)然是絕對強(qiáng)度(相對強(qiáng)度也是通過絕對強(qiáng)度換算出來的)。我們需要用絕對強(qiáng)度來定量時,就需要這部分平時不?吹男畔⒘恕


    另外,在談到色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法時,待分析物與實(shí)驗(yàn)測量信號的關(guān)系之中又多了一層色譜,即待分析物含量->色譜流出物中樣品含量->質(zhì)譜信號。與EI譜圖分析以相對強(qiáng)度為主不同,在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時,信號的絕對強(qiáng)度就成了我們天天都要關(guān)心的內(nèi)容,因?yàn)橘|(zhì)譜信號強(qiáng)度隨時間的變化就是實(shí)驗(yàn)的色譜圖,通常以總離子強(qiáng)度或者某一特定質(zhì)荷比離子的強(qiáng)度作圖。


    1定量的兩種方法

     

    說過了為什ô質(zhì)譜可以定量,下面我們來看看具體的定量方法。常用的定量方法有兩種,外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法。

    外標(biāo)法

    用已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品A和δ知量的待測樣品A分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn);我們會得到以下三個信息:標(biāo)準(zhǔn)樣品的量(已知);標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號強(qiáng)度;待測樣品的信號強(qiáng)度。(假設(shè)樣品的響應(yīng)=常數(shù)*濃度,從這三個信息即可算出待測樣品的量。)

     

    為了更加精確地測定δ知量的樣品,我們希望標(biāo)準(zhǔn)樣品的信號強(qiáng)度與待測樣品的信號強(qiáng)度盡量接近(以減少非線性響應(yīng)的影響)。因此常用的外標(biāo)法會測量一系列已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品,繪制一條工作曲線,再用擬合的方法確定δ知樣的量。




    內(nèi)標(biāo)法

     

    外標(biāo)法主要有以下兩方面的局限:1標(biāo)樣和待測樣是獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的,實(shí)驗(yàn)間的偶然誤差無法消除;2標(biāo)樣和待測樣的基質(zhì)(即除待分析物外的其它成分)不同,基質(zhì)有可能會帶來不同的影響,也會產(chǎn)生誤差。


    那ô,如果我們把已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品B直接加入待測樣品A,就可以把標(biāo)準(zhǔn)樣品和δ知樣品的測定在同一次實(shí)驗(yàn)和同樣基質(zhì)中完成,也就消除了兩次實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)不同造成的誤差,這就是內(nèi)標(biāo)法。


    (如果加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品是同種物質(zhì)A,那ô由于它們不可區(qū)分,只通過一次實(shí)驗(yàn)是不能定量待測樣的,這時我們在加入標(biāo)樣前后分別進(jìn)行兩次測量,即測量待測樣及待測樣+標(biāo)樣的信號,即可計算出待測樣的量。)

     

    2質(zhì)譜相關(guān)的特殊定量細(xì)節(jié)

     

    同λ素稀釋


    前面內(nèi)標(biāo)法的介紹中我們可以發(fā)現(xiàn),最理想的內(nèi)標(biāo)物既要和待測樣相同(具有相同的響應(yīng)系數(shù))又要不同(儀器可以區(qū)分二者的信號),這對ì盾的集合體就是同λ素內(nèi)標(biāo)。

     

    由于不同同λ素的化合物具有近似相同的物理化學(xué)性質(zhì),離子化時的響應(yīng)通常也是相同的,而它們具有不同的質(zhì)荷比m/z,即可在質(zhì)譜中被區(qū)分出來。因此同λ素標(biāo)準(zhǔn)品是最理想的內(nèi)標(biāo)物。

     

    另外,由于某些元素的天然同λ素分布有一定的比例,當(dāng)我們加入一定量的同λ素內(nèi)標(biāo)時,可以把對信號絕對強(qiáng)度的測量轉(zhuǎn)化為對信號相對比例的測量,從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

    圖片

     

    選擇反應(yīng)監(jiān)測


    在不太復(fù)雜的體系中,我們只要按照分子量就可以定性某種化合物了。但對于復(fù)雜混合物(如石油產(chǎn)品/生物樣品)而言,很多化合物具有相同或相近的質(zhì)量(同分異構(gòu)體質(zhì)量完全相同,有些化合物分子量非常接近,如CO和N2,要考慮儀器的質(zhì)量分辨率是否能區(qū)分二者),此時僅靠測量質(zhì)量就不能確定這個化合物是否就是我們關(guān)心的“the one”了。

     

    在串聯(lián)質(zhì)譜 (Tandem MS) 儀器中,我們不僅可以把質(zhì)譜儀理解為一個稱量離子的“天平”,它還具有了離子“鑷子”(選擇某個特定的離子把它分離出來)和“剪刀”(把某個/某些離子激活并打成碎片)的功能。


    通過母離子和子離子的兩步選擇,我們可以在復(fù)雜體系中精確定λ到我們關(guān)心的化合物,同時,兩次離子選擇還可減少復(fù)雜基質(zhì)的干擾,降低背景噪聲(獲得更低的檢出限)并提高方法的動態(tài)范Χ。因此選擇反應(yīng)監(jiān)測是目前色譜(氣相色譜/液相色譜)-質(zhì)譜聯(lián)用中最常用的定量方法。

     

    編輯:songjiajie2010

     
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