【實(shí)驗(yàn)原理】
聚酰胺薄膜層析是60年代以后發(fā)展起來的一種新的層析方法,特別適用于氨基酸及其衍生物的分析。具有靈敏度高、分辨率強(qiáng)、操作方便快捷等特點(diǎn)。
聚酰胺是一類化學(xué)纖維素原料,即錦綸(尼龍)。由乙二酸和乙二胺聚合而成的,稱錦綸66。
由于分子中含有大量的酰胺基團(tuán),故稱聚酰胺。聚酰胺薄膜是在滌綸片基上涂上一層錦綸制成的。聚酰胺對(duì)許多極性物質(zhì)有吸附作用,這是由于聚酰胺的-C=O和-NH- 能與被分離物質(zhì)的一定基團(tuán)形成H鍵。如酚類(黃酮類、鞣質(zhì))和酸類(氨基酸、核苷酸)能以其羥基與酰胺鍵的羰基形成H鍵。在層析過程中,當(dāng)樣品隨流動(dòng)相通過聚酰胺薄膜時(shí),由于聚酰胺與各極性分子產(chǎn)生H鍵吸附能力的強(qiáng)弱不同,從而可將樣品中各成分分離。
物質(zhì)分離后,層析點(diǎn)在圖譜上的位置,即在濾紙上的移動(dòng)速率,用Rf來表示。
在一定條件下,每個(gè)物質(zhì)都有特定的Rf值,因此,用Rf可鑒定不同的物質(zhì)。
無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法(紫外照射)或顯色法鑒定。氨基酸層析圖譜常用茚三酮作顯色劑。本實(shí)驗(yàn)利用單向上行層析法鑒定氨基酸。
【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】
(一) 試劑
1. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml):三種氨基酸是賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸,分別配成上述濃度的溶液。
2. 氨基酸混合液(每種氨基酸5mg/ml)
3. 展層劑:正丁醇:12%氨水:95%乙醇=13: 3: 3(V/ V)
4. 0.1%茚三酮-正丁醇液。
(二) 器材
聚酰胺薄膜,毛細(xì)管,層析裝置,電吹風(fēng)機(jī),噴霧器, 塑料手套等。
【實(shí)驗(yàn)方法】
(一) 薄膜的剪裁
取薄膜(7cm×10cm)一張,在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一直線,在此直線上每隔1厘米作一記號(hào)為點(diǎn)樣處(外側(cè)兩點(diǎn)距邊緣2cm)。
(二) 點(diǎn)樣
氨基酸的點(diǎn)樣量以5ul為宜。點(diǎn)樣時(shí),用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品,與薄膜垂直方向輕輕碰點(diǎn)樣處,每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過2mm。點(diǎn)樣過程中,必須在第一點(diǎn)樣品干后再點(diǎn)第二滴。為加快樣品干燥,可用吹風(fēng)機(jī)吹干,注意溫度不宜過高,以免損壞氨基酸。
(三) 展層
在層析缸中放一個(gè)小培養(yǎng)皿,培養(yǎng)皿中倒入適量展層劑,將點(diǎn)好樣品的薄膜斜立于培養(yǎng)皿中(注意點(diǎn)樣的一端在下),展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線1厘米。當(dāng)溶劑前沿距上邊緣1厘米處時(shí),取出膜片,立即用筆標(biāo)出溶劑前沿的位置,自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。
(四)定性鑒定
用0.1%茚三酮-正丁醇液在薄膜的一面均勻噴霧。晾干后,用一直尺測量每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離,求其比值,即得各種氨基酸的Rf值。
在層析圖譜上,對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的位置(Rf值),確定氨基酸混合樣中氨基酸的種
類及位置。
【注意事項(xiàng)】
1. 選用合適、潔凈的薄膜。勿用手直接接觸薄膜。
2. 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大(其直徑應(yīng)小于2mm)。吹風(fēng)機(jī)溫度不宜過高,否則斑點(diǎn)變黃。
3. 根據(jù)一定目的、要求,選擇合適的溶劑系統(tǒng)。