蛋白質(zhì)經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分,如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨,肽等最后成為氨基酸,氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。
水解后的pro和水解前的pro在物理特性,化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的,其差別與水解的程度有密切關(guān)系,分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度,也就可以評價食品的營養(yǎng)價值。
氨基酸不是單純的一種物質(zhì),用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴,不能普遍使用),對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中,所以需要測定總的氨基酸量,它們不能以氨基酸百分率來表示,只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸態(tài)氮)的百分率表示,當(dāng)然,如果食品中只含有一種氨基酸,如味精中的谷氨酸,就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。
食品在評價蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值時,除了測定pro的含量,氨基酸氮含量,還需要對各種氨基酸進(jìn)行分離,鑒定,尤其對8種人體必需氨基酸進(jìn)行定量定性分析。
一.單指示劑甲醛滴定法:
1原理:氨基酸具有酸,堿兩重性質(zhì),因為氨基酸含有-COOH基,而-COOH基顯示酸性,又含有-NH2,-NH2則顯示堿性,由于-COOH基和-NH2的相互作用,使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽,當(dāng)加入甲醛溶液時,-NH2與甲醛結(jié)合,其堿性消失,破壞內(nèi)鹽的存在,就可用堿來滴定-COOH基,以間接方法測定氨基酸的量,反應(yīng)式以三種形式存在。
用堿完全中和-COOH基時的PH值為8.4~9.2。
2試劑:
(1)40%中性甲醛溶液:以百里酚酞作指示劑,將甲醛用1N NaOH溶液中和(淡蘭色)。(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3操作步驟:
稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中(如為固體樣加水50ml)→加兩滴指示劑→用0.1N NaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應(yīng)消失→再用0.1N NaOH溶液滴定淡蘭色,記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。
計算:氨基酸態(tài)氮=(N×V×0.014×100)/W×100
二.雙指示劑甲醛滴定法
1原理:
與單色法相同,只是在此法中使用了兩種指示劑,從分析結(jié)果看,雙指示劑甲醛滴定法與
亞硝酸氮氣容量法(此法操作復(fù)雜,但準(zhǔn)確,不作介紹)相近,單色滴定法稍偏低,主要
因為單指示劑甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作為中性紅的終點,PH值為7.0,從理論計
算看,雙色滴定法比單色滴定法準(zhǔn)確。
2試劑:同單指示劑一樣,多一個0.1%中性紅(50%乙醇溶液)
3操作步驟:
取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1N NaOH滴定終點(由紅
變琥珀色),記錄用量,另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1N
NaOH 滴至淡蘭色。
計算:
氨基酸態(tài)氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100
V1——用中性紅為指示劑時,堿液所消耗的體積
V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時標(biāo)液消耗量
0.014——氮的毫克當(dāng)量濃度
注意事項:
(1)單色指示劑甲醛滴定法,用堿完全中和—COOH基時的pH為8.5—9.5
(2)測定樣品的顏色較深,應(yīng)加活性炭脫色之后再滴定
三.茚三酮比色法:
1原理:氨基酸在一定pH范圍內(nèi),能與茚三酮生成蘭紫色化合物?梢杂帽壬ǘ繙y定。
2試劑:
(1)磷酸緩沖液(pH.8.04)制備方法如下:
稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml
稱NAH2PO4·12H2O 11.9380g分別溶解定容500ml
取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液
(2)2%茚三酮溶液:
稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫(SnCl2·H2O)攪拌過濾(作防腐劑)→
于冷暗處過夜→定容50ml
① 氨基酸標(biāo)液
稱干燥氨基酸(如異亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶
定容100ml,即得200Ug/ml標(biāo)液
3操作方法:
(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:
取7個25ml容量瓶,吸取標(biāo)液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7個25ml容量瓶,加水補充
至容積為4ml,然后加茚三酮和緩沖液各1ml,于水浴加熱15分鐘,冷卻后定容25ml,靜置
15分鐘,在570nm下測消光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)樣品測定:
取樣品5.00~10.0g(液體樣5-10ml)→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用
30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘,
冷卻定容,靜置15分鐘于570nm下測定消光值,按下式計算氨基酸含量。
氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100
C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量(Ug)
W——測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量(g)
注意事項:
茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色,使用前要進(jìn)行純
化,方法如下:、
取10g茚三酮容于40ml熱水中,加一克活性炭,搖勻靜置30分鐘,過濾,將濾液放入冰箱中
過濾,即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶,過濾,用2ml冷水洗滌結(jié)晶,置干燥皿中干燥,裝瓶備用。
思考題:
1 試述蛋白質(zhì)測定中,樣品消化過程所必須注意的事項,消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化?為什么?
2 樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前,為什么要加入氫氧化鈉?這時溶液發(fā)生什么變化?為什么?如果沒有變化,說明什么問題?須采用什么措施?
3 硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用?
4 試述氨基酸態(tài)氮的測定原理!
5 結(jié)果計算中為什么要乘上蛋白質(zhì)系數(shù)?
實驗:①水果中酸度的測定。
②糕點中和脂肪的測定。