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    PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒--MagExtractor®-PCR & Gel Clean u

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-05-22
    產(chǎn)品索引 5872
    中文名稱: PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒
    英文名稱: MagExtractor®-PCR & Gel Clean up-
    產(chǎn)品編號: NPK - 600

    產(chǎn)品類別:

    分子生物學(xué)
    生產(chǎn)廠家: TOYOBO
    產(chǎn)品價(jià)格: 300元
    產(chǎn)品規(guī)格: 50次
    DNA Fragment Purification Kit
    MagExtractor®
    -PCR & Gel Clean up-
    使用說明書
    (Code No. : NPK – 601)
    TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
    OSAKAJAPAN
     —目錄—
    [1] 前言 ........................................................................................... 1
    [2] 純化流程...................................................................................... 2
    [3] 試劑盒中所包含的物品................................................................. 3
    [4] 試劑盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
    [5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
    [6] 回收瓊脂糖凝膠........................................................................... 5
    [7] 疑難解答...................................................................................... 8
     
    注意:
           本試劑盒中所包含的都是研究用試劑。請不要用于診斷,臨床等場合。在使用本試劑盒的時(shí)候,請嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的基本注意事項(xiàng),注意安全。由于本試劑盒內(nèi)含有對人體有害的試劑,所以請務(wù)必嚴(yán)格遵守各試劑的相關(guān)使用說明書,按要求使用保護(hù)罩等防護(hù)措施。

     [1] 前言
           MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic(鹽)試劑存在的情況下,核酸能吸附在硅膠上的特性1,用于手動(dòng)對DNA片段進(jìn)行純化。本試劑盒采用磁硅膠粒子,若使用磁性臺架,則能最大限度地減少復(fù)雜的離心操作,能夠快速地的純化DNA片段。
    1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
    特征
    ·從DNA溶液(約100μl),以及TAE·TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中,
    能夠以平均回收率60~70%比例回收DNA片段(約100bp~50kbp)。
    ·能夠在5分鐘之內(nèi)從DNA溶液中,或者在15分鐘之內(nèi)從瓊脂糖凝膠
    中回收DNA片段。
    ·由于在室溫下瓊脂糖凝膠可以被融解,因此無需進(jìn)行加熱反應(yīng)。
     
    * 要徹底去除混雜在回收液中的乙醇時(shí)則需要進(jìn)行加熱處理(55℃)。
    試劑盒的用途
    ·脫鹽,去除dNTPs。
    ·去除引物。
    ·去除酶(堿性磷酸酶等)。
    ·從電泳后的瓊脂糖凝膠塊中回收DNA。
    回收的DNA的用途
    ·RI.Non-RI測序反應(yīng)
    ·限制酶反應(yīng)
    ·標(biāo)記反應(yīng)
    ·雜交反應(yīng)
    ·連接反應(yīng)
    ·轉(zhuǎn)化反應(yīng)
    ·擴(kuò)增反應(yīng)
    [2] 純化流程      
     下圖顯示為使用MagExtractor-PCR &
      Gel Clean up-時(shí)的純化流程。

    純化DNA片段
    Elute
    75%乙醇
    洗凈液
    溶出液
         磁石
    磁性或離心分離
    磁珠
    Wash
     
    Bind
     
    Melt
     
    凝膠塊
    吸附液
    電泳后的凝膠

    [3] 試劑盒中所包含的物品    
     
           本試劑盒中包含以下試劑。(200次份)
          
     
    試劑量
    保存條件
    吸附液*
    88ml
    避光室溫保存
    洗凈液*
    132ml
    室溫保存
    磁珠
    7ml
    室溫保存
     
    *吸附液,洗凈液在低溫情況下會析出結(jié)晶。請一邊用手捂暖,一邊
    將其倒轉(zhuǎn)混合讓結(jié)晶溶解后使用。另外,吸附液及洗凈液內(nèi)含有蛋白
    變性劑。在使用時(shí)務(wù)必注意,萬一沾到身體,請立刻用清水沖洗。
     
    [4] 試劑盒以外所需要的其他物品
     
    1.試劑
    ·滅菌蒸餾水<溶出液>
    ·75%乙醇<洗凈用>
     
    2.器具,器材
    ·1.5ml小型試管用磁性臺架
    ·簡易臺式離心機(jī)
    ·漩渦混合器
    ·Heat Block 55℃(用于在需要去除混于回收液中的乙醇的場合)
     
    *可使用本公司的磁性臺架Magical Trapper(Code No.:MGS-101)等產(chǎn)品。
     [5] 回收DNA溶液
     
    1.前言
    ·本操作程序用于從DNA溶液(約100μl)中回收DNA片段。
    ·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kb。另外,40bp以下的核酸
    幾乎能夠被加以除去。
    · 磁珠的最大吸附量為每30μl磁珠大約吸附5μg。使用時(shí)請以2.5μg左右為參考量。
    ·能夠從PCR反應(yīng)液,限制酶反應(yīng)溶液,堿性磷酸酶反應(yīng)液等各種反
    應(yīng)液中回收DNA。
    ·回收后的DNA,能夠用于限制酶處理、測序、連接、標(biāo)記、雜交等多種反應(yīng)
    2.操作程序      
    DNA溶液(100μl)1
    ↓← 400μl吸附液
    ↓← 30μl磁珠2)
    ↓不時(shí)用漩渦混合器攪拌,并放置約1~2min(室溫)
    B/F(固/液)分離3
    ↓←(600μl洗凈液)4
    ↓漩渦混合器攪拌10sec,
    B/F分離。3
    ↓←1ml75%乙醇4
    ↓漩渦混合器攪拌10sec,
    B/F分離。3
    瞬時(shí)高速離心,徹底去除上清部分。
    (打開小型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)4
    ↓←25~100μl蒸餾水
    ↓漩渦混合器攪拌10sec,
    (在無法充分將粒子分離的情況下,請用pipetting來分離粒子。)
    ↓放置2min
    B/F分離,回收上清液。5
    1)請盡量不要含礦物油。
    2)使用磁珠前,請徹底懸濁混合后再使用。
    3)將試管放置在磁性臺架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去除
    上清部分。通過乙醇清洗時(shí),可以通過將上清液倒入其他容器進(jìn)行去除。
    B/F分離時(shí)推薦使用對應(yīng)于微型試管的磁性臺架,但也可用簡易臺式離心機(jī),用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進(jìn)行分離。g會根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,所以請調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得能更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過度。
    4)請參照3.的表。
    5)回收液中少量混入的磁珠并不會有礙下一次的反應(yīng),但在測定吸附度
    等場合時(shí),請通過瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
     
    3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
    ·洗凈工序,加熱工序可以省略(請參照下表)
    用途
    洗凈
    干燥
    備注
    洗凈液
    75%乙醇溶液
    測序,限制酶反應(yīng),連接反應(yīng)等的前處理
    1
    標(biāo)準(zhǔn)操作程序;厥盏暮怂崮苡糜Low Buffer系列的限制酶切斷。
    鹽的混入會產(chǎn)生影響的場合
    2
    吸附液和洗凈液含有高濃度的鹽分。
    乙醇的混入會產(chǎn)生影響的場合
    1次(2次)
    55℃,5min
    用于易受乙醇影響的前處理。
    要去除混入的酶的場合
    1
    1次(2次)
    用于去除堿性磷酸酶等。
    要通過吸光度來準(zhǔn)確定量核酸濃度的場合
    1
    2
    吸附液內(nèi)含有能吸收紫外線的物質(zhì)。
     
    ·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
    液和磁珠的使用量。此時(shí),無需減少75%乙醇溶液的使用量。
    [6] 回收瓊脂糖凝膠
     1.前言
    ·本操作程序適用于從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中回收
    DNA片段。本操作程序是以瓊脂糖濃度2%以下的凝膠為對象。
    要使用2%以上的凝膠時(shí),推薦所使用凝膠的量少于0.3g。另外,本
    操作程序不需要使用特殊的低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠。
    ·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kbp。
    ·回收后的DNA主要用于連接反應(yīng)、標(biāo)記、測序等反應(yīng)。
     
    2.操作程序
    瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色。
    在UV照射下(Long wave),為了使得目標(biāo)條帶盡可能地變小,使
    用切割刀或手術(shù)刀等進(jìn)行切開。
    把切開的瓊脂糖切細(xì),放到1.5ml小型試管中。(此時(shí)稱得重量,如
    果大于0.3g則分幾次進(jìn)行。)1
    ↓←400μl吸附液
    在凝膠完全溶解之前,將其放置在室溫中,并不時(shí)進(jìn)行攪拌。2
    ↓←30μl磁珠3
    ↓經(jīng)常用漩渦混合器攪拌,并放置2min(室溫),
    B/F分離。4
    ↓←600μl洗凈液
    ↓漩渦混合器攪拌10sec,
    B/F分離。4
    ↓←1ml75%乙醇溶液5
    ↓漩渦混合器攪拌10sec,
    B/F分離。4
    瞬時(shí)高速離心,徹底去除上清部分。
    (打開微型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)5

     
    ↓←25~100μl蒸餾水
    ↓漩渦混合器攪拌10sec
    (在無法充分分開粒子的情況下,請用pipetting來分散粒子。)
    ↓放置2min
    B/F分離,回收上清液6
     
    1)   將瓊脂糖凝膠制成切片,以利于溶解。
    2)   如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或凝膠難以溶解時(shí),請加溫至55℃
    5min。
    3)   使用磁珠前,請徹底混合后再使用。
    4) 將試管放置在磁性臺架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去
    除上清部分。要洗凈乙醇,也可以通過將上清液倒入其他容器來去除。
    B/F分離時(shí)推薦使用對應(yīng)于微型試管的磁性臺架,但也可使用簡易臺式離心機(jī),用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進(jìn)行分離。g會根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,故請調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過度。
    5) 請參照3.的表。
    6) 回收液中混入少量磁珠并不會有礙下一次的反應(yīng),但在測定吸附
    度等場合時(shí),請通過瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
     
    3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
    ·洗凈工序,加熱工序可以省略(請參照下表)
    用途
    洗凈
    干燥
    備注
    洗凈液*
    75%乙醇溶液
    連接反應(yīng), 測序等
    1
    1
    標(biāo)準(zhǔn)操作程序。
    鹽的混入會產(chǎn)生影響的場合
    1
    2
    吸附液和洗凈液中含有高濃度的鹽分。
    乙醇的混入會產(chǎn)生影響的場合
    1
    1次(2次)
    55℃,5min
    用于容易受乙醇影響的前處理。
    要通過吸光度來準(zhǔn)確定量核酸濃度的場合
    1
    2
    吸附液內(nèi)含有吸收紫外線的物質(zhì)。
    *從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí),必須用洗凈液清洗。

     
    ·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
    液和磁珠的使用量。此時(shí),無需減少75%乙醇溶液的使用量。
          
    [7] 疑難解答      
     1.回收量低
    原因
    對策
    去除乙醇不徹底
    瞬時(shí)高速離心后,請仔細(xì)去除75%乙醇溶液。
    溶出不充分
    通過10mM Tris-HCIpH8.0),或者TE buffer能夠提高溶出的效率。另外,如果加溫至55℃保持2min能夠更加有效地提高溶出效率。
    吸附時(shí)間不合適
    如果吸附過剩,回收量則會變少。最恰當(dāng)?shù)奈綍r(shí)間是,對于DNA溶液為12min,對于凝膠則為2min
    溶出時(shí)的攪拌不充分
    溶出時(shí),如果磁珠的混合不充分,回收量會減少。在瞬時(shí)高速離心后,磁珠會在底部結(jié)塊,請仔細(xì)將其散開。特別是在從瓊脂糖凝膠中進(jìn)行純化的時(shí)候,結(jié)塊的磁珠會比較難以重新散開。
    瓊脂糖凝膠的量大于0.3g
    請減少瓊脂糖凝膠的量。
    使用2%以上的瓊脂糖
    請減少瓊脂糖凝膠的量。
    沒有用洗凈液清洗
    從瓊脂糖凝膠中回收DNA時(shí),請務(wù)必先用洗凈液清洗。
     
    2.回收的核酸的吸光度不準(zhǔn)確
    原因
    對策
    清洗不充分
    吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。要對回收的核酸定量,請用洗凈液以及75%乙醇溶液來清洗。
    混入了吸附液
    吸附液中含有吸收紫外線的物質(zhì)。請仔細(xì)去除吸附液。用面紙等擦拭試管的蓋子上沾有的吸附液,可以有效改善狀況。
     

     
    3.回收后的核酸不能良好地進(jìn)行反應(yīng)
           原因
    對策
    鹽阻礙了反應(yīng)
    請?zhí)砑觾纱?/span>75%乙醇溶液進(jìn)行清洗的工序。吸附液和洗凈液都含有高濃度的鹽分。
    乙醇阻礙了反應(yīng)
    請按照操作程序,對乙醇進(jìn)行干燥處理。
    酶未能完全去除
    要去除反應(yīng)液中的堿性磷酸酶等酶,請用洗凈液以及75%乙醇溶液進(jìn)行清洗。
    反應(yīng)用的酵素過少
    從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí),反應(yīng)用的酶量應(yīng)比通常要多,這樣就能得到準(zhǔn)確良好的結(jié)果。
    使用的瓊脂糖級別不夠
    請使用高級別的瓊脂糖。
    從瓊脂糖凝膠中分離條帶時(shí),受到的紫外線照射過多
    請用Long wave365nm附近)的紫外線來進(jìn)行切片工作。
     
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