蛋白濃度測(cè)定的方法有很多,但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果精確,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測(cè)試則不太合適;Lowry法精確度較高,但是比較費(fèi)時(shí),且每步的時(shí)間要求相對(duì)嚴(yán)格;Bradford法靈敏簡(jiǎn)便,但易受去垢劑的影響;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受歡迎。
3. Lowry法:
原理:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。通過(guò)比色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。
適合于測(cè)定20mg/L-400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液,可檢測(cè)的蛋白質(zhì)量低達(dá)5mg,通常測(cè)定范圍是20~250mg。
優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,可檢測(cè)低至1μg/mL的蛋白質(zhì);對(duì)于大部分蛋白質(zhì)都有較好的線性關(guān)系。
缺點(diǎn):
1.操作相對(duì)較復(fù)雜,需要多個(gè)步驟;
2.干擾物比較多,不僅還原劑和去垢劑會(huì)產(chǎn)生干擾,酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。