DNA序列測定是分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一，是了解基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。DNA測序技術(shù)的不斷完善和儀器自動(dòng)化程度的不斷提高，為大型基因組測序奠定了基礎(chǔ)，當(dāng)今大多數(shù)蛋白質(zhì)序列都是通過基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來的。DNA測序方法主要有雙脫氧鏈終止法（Sanger法）和化學(xué)降解法（Maxam-Gilbert法）。目前不管是傳統(tǒng)的手工測序法，還是儀器自動(dòng)測序法均使用前者，而儀器自動(dòng)測序法以其快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)得以廣泛應(yīng)用。我室于1995年，引進(jìn)美國PE公司的373A型DNA序列測定儀，儀器專管共用，兩年來為校內(nèi)、外科研人員提供測序服務(wù)，現(xiàn)將該儀器使用中的一點(diǎn)體會(huì)報(bào)告如下。

1、測序原理和特點(diǎn)

373A型DNA測序儀使用雙脫氧鏈終止法（Dye-primer或Dye-terminator）進(jìn)行DNA測序反應(yīng)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，實(shí)時(shí)檢測自動(dòng)讀序。該儀器與其它儀器相比較，其顯著特點(diǎn)是它能用4種不同的熒光分子分別標(biāo)記4種反應(yīng)引物（Dye-primer法）或4種dNTP（Dye-terminator法）。4個(gè)反應(yīng)分開進(jìn)行，產(chǎn)物合并在一個(gè)泳道中電泳分離，根據(jù)每條區(qū)帶的熒光不同加以識(shí)別讀序，這樣不但可提高每次分析樣品的數(shù)量（373A型每次可測定36個(gè)樣品），又克服了泳道間差異造成的讀序誤差。與傳統(tǒng)的手工測序比較：①安全，無污染；用熒光素代替同位素，避免了放射性同位素的污染和對(duì)人體的危害；②模板用量大大減小，單鏈DNA模板用量為0.4μg，雙鏈DNA質(zhì)粒模板用量為0.8μg，PCR產(chǎn)物用量為5ng～20ng；③測序長度大大提高，一般可達(dá)450bp～500bp。

2、體會(huì)

2.1　模板純化是前提　DNA測序所用的模板可以是質(zhì)粒DNA，也可以是PCR產(chǎn)物，但使用高質(zhì)量的模板是測序成功的前提。DNA純化的方法很多，如聚乙二醇沉淀法、瓊脂糖凝膠電泳法、氯化銫梯度離心法、高效液相色譜法（HPLC法）和一次性微柱法等。用這些方法純化的DNA都可用于DNA測序，但從我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，HPLC法和微柱法（如Promega公司的Wizard Plus Miniprep DNA Purification System）效果最好。為了保證測序的成功率，測序模板純化后，必須先進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠中含0.5mg/L溴化乙錠，樣品濃度為0.2g/L，上樣量為1μl）鑒定其純度，要求條帶清晰，無雜帶，無拖尾，否則應(yīng)重新純化，以保證測序的結(jié)果。

2.2　測序反應(yīng)是關(guān)鍵　測序反應(yīng)是DNA自動(dòng)測序的第一步，也是測序成敗的關(guān)鍵所在。符合測序要求的DNA模板，經(jīng)過測序反應(yīng)后,會(huì)形成數(shù)百條帶有不同熒光的核苷酸鏈，且每條核苷酸鏈的堿基數(shù)只相差1個(gè)堿基。目前，我們使用的測序試劑為PE公司提供的DNA測序試劑盒（Dye-primer或Dye-ter-minator），其中每種試劑的濃度為產(chǎn)品的最佳組合，而且測序反應(yīng)的條件（變性、退火、延伸的時(shí)間和溫度）與試劑盒配套使用。這就必須按照試劑盒的要求控制好模板的濃度，即使純度合格的DNA模板其濃度也很重要，單鏈DNA模板為0.10g/L，雙鏈質(zhì)粒模板為0.20g/L，PCR產(chǎn)物根據(jù)其片段的長度取適當(dāng)?shù)牧�，濃度過高或過低都會(huì)直接影響測序的結(jié)果。根據(jù)我們的使用情況，濃度太高時(shí)，電泳條帶信號(hào)強(qiáng)，會(huì)出現(xiàn)平頭峰，測序結(jié)果短（一般＜250bp），而且誤差大；濃度過低時(shí)，電泳條帶信號(hào)弱，噪聲多，誤差大，可信度差。在使用Dye-termina-tor法測序時(shí)（一般模板為PCR產(chǎn)物），除模板的純度和濃度符合要求外，所用引物的純度和濃度也很重要，引物應(yīng)為測序級(jí)純度，濃度應(yīng)準(zhǔn)確定量。

2.3　電泳條件是保證　前面已提到，測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后,實(shí)時(shí)進(jìn)行自動(dòng)讀序，要使只差1個(gè)堿基的DNA鏈達(dá)到最佳分離，電泳的條件至關(guān)重要。373A型DNA測序儀使用的是尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為4.75%，恒功率（30W），這些條件相對(duì)固定，所以電泳的成敗主要取決于凝膠的配制。一是電泳試劑的純度。由于該系統(tǒng)是檢測熒光信號(hào)，所以要求試劑不能含有雜質(zhì)，我們使用Sigma公司的試劑和部分國產(chǎn)分析純試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。二是凝膠配制。要求各種試劑的稱量要準(zhǔn)確，除凝膠濃度準(zhǔn)確外，TBE緩沖液的配制尤為重要，否則會(huì)影響電泳結(jié)果，造成測序失敗，這是由于TBE的離子濃度的高低可直接引起電泳時(shí)電壓的升高或降低。三是灌膠要仔細(xì)。要防止產(chǎn)生氣泡、波浪紋等而影響電泳分離。

總之，在使用全自動(dòng)DNA測序儀時(shí)，模板的純度和濃度、測序反應(yīng)、電泳分離等環(huán)節(jié)都會(huì)影響測序的結(jié)果，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會(huì)造成前功盡棄。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，在測序試劑盒質(zhì)量有保證、儀器工作正常、實(shí)驗(yàn)人員精心操作的前提下，測序模板的純度和濃度是測序成功的關(guān)鍵，測序失敗往往是由于模板的純度不夠或濃度不準(zhǔn)所致。兩年來中我們測定了數(shù)百份樣品，成功率達(dá)到88%。其中Dye-primer法測定的樣品占95%，單鏈DNA模板單向測序可達(dá)700bp～800bp，雙鏈質(zhì)粒模板單向測序可達(dá)500bp～600bp。