目的 探討食品添加劑KBrO3對哺乳類組織中82羥基鳥嘌呤糖基酶的氧化誘導作用。方法 比較用KBrO3處理大鼠后,其腎和肝中修復(fù)酶活性的變化規(guī)律。酶活性分析用高效液相色譜P電化學檢測法。結(jié)果 腹膜下給予80mgPkg劑量KBrO3后,在腎臟發(fā)現(xiàn)酶活性在3h時顯著升高,而在6h時,其活性達到高大值(1.25±0.14)pmol,該值是0h的6倍。然后,活性開始下降并在12h回到0h水平;不加處理時,其活性只有(0.20±0.06)pmol,而在20、40、80及160mgPkgKBrO3腹膜下給予時,其活性分別是(0.33±0.09)、(0.53±0.10)、(0.75±0.13)及(1.30±0.08)pmol,在40mgPkg以上時活性顯著增高,且顯示劑量反應(yīng)關(guān)系。在腎中觀察到該酶活性變化是時間與劑量依賴性的,而在肝中未發(fā)現(xiàn)這種變化。結(jié)論 哺乳類組織中82羥基鳥嘌呤糖基酶能被氧化誘導,提示DNA中氧化損傷的修復(fù)是機體在有氧環(huán)境中生存的重要過程。
DNA中的鳥嘌呤容易被活性氧自由基羥化成為8-羥基鳥嘌呤,這種堿基改變能誘導GCyTA轉(zhuǎn)化,已證實DNA氧化損傷與心血管疾病、老化等慢性病有關(guān)。因此生物體存在預(yù)防8-羥基鳥嘌呤所致遺傳結(jié)構(gòu)完整性損害的防御機制。
8-羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶同時具有8-羥基鳥嘌呤糖基酶活性及腺嘌呤核酸內(nèi)切酶活性,該酶分兩步修復(fù)DNA中82羥基鳥嘌呤,先將82羥基鳥嘌呤當成自由堿基移去,然后在腺嘌呤位點切開磷酸二酸鍵的3c和5c端。
最近發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的8-羥基鳥嘌呤內(nèi)切酶(糖基酶)能受氧張力增高的誘導,該酶的適應(yīng)性反應(yīng)使其在氧化刺激下能發(fā)揮更有效的對抗DNA氧化損傷的作用。至今尚未見有哺乳類組織82羥基鳥嘌呤糖基酶誘導的研究。因此,我們嘗試在大鼠經(jīng)KBrO3處理后,其肝和腎中8-羥基鳥嘌呤糖基酶的活性改變。KBrO3是一種選擇性作用于腎臟的氧化性致癌物。在本研究中,僅發(fā)現(xiàn)腎臟8-羥基鳥嘌呤糖基酶的活性被氧化誘導,而肝中未被誘導。腎臟中活性增高呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。

1 材料和方法

1.1 寡脫氧核苷酸作為底物
用于82羥基鳥嘌呤糖基酶的寡脫氧核苷酸的合成按照Kuchino等描述的方法(1987年)。
1.2 以[14C]82羥基鳥嘌呤作為內(nèi)標物
82羥基鳥嘌呤定量的內(nèi)標物[14C]82羥基鳥嘌呤用[14C]鳥嘌呤制備,按照Degan等描述的程序(1991年)。
1.3 以KBrO3作用于動物
0.9%KBrO3鹽水通過腹膜內(nèi)注射雄性Fisher大鼠,大鼠體重約120g。給藥前大鼠禁食一夜,為觀察KBrO3作用的時間效應(yīng),采用80mgPkg劑量;按24h時間間隔殺死大鼠。為觀察KBrO3作用的劑量效應(yīng),按不同劑量,最高至160mgPkg給藥,給藥后9h殺死,分離其腎和肝來制備組織抽提物。
1.4 組織提取物制備
取出大鼠的腎和肝用0.9%冷鹽水沖去殘血,腎、肝用液氮冷卻貯存于-70e備用,用2倍體積的勻漿緩沖液研磨和勻漿冷凍器官,懸浮的勻漿用1.5%的鏈霉素混合,以除去核酸,離心后上清液透析,用作82羥基鳥嘌呤糖基酶分析的組織提取物。上述步驟在4e以下操作。
1.5 酶分析
將4pmol雙鏈DNA底物同5mg上述腎和肝的提取物在30e下孵化2h,1ml反應(yīng)混合物包括50mmolPLTris2HCl、50mmolPLKCl及1mmolPLEDTA,pH值為7.5,通過90e加熱3min來終止反應(yīng),按6000rPmin離心10min,取900Ll上清液加100Ll約400次Pmin14C8-羥基鳥嘌呤內(nèi)標液,該混合物加入經(jīng)8-羥基鳥嘌呤單克隆抗體制備的免疫親和柱。經(jīng)純化的82羥基鳥嘌呤溶于50Ll水,注入5Lm,416mmx25cmHPLC柱,進行高效液相色譜、電化學檢測分析,測量電化學檢測器上顯示的82羥基鳥嘌呤峰高及8-羥基鳥嘌呤洗提液的放射活性,峰高用于82羥基鳥嘌呤的定量,是反應(yīng)介質(zhì)和加入14C282羥基鳥嘌呤的總和。從總量中減去內(nèi)標物即得到原反應(yīng)介質(zhì)中8-羥基鳥嘌呤的量。所加14C282羥基鳥嘌呤可通過校準曲線比較其峰高與放射活性來定量。洗提液的放射活性可用來定量在免疫親和柱純化過程中8-羥基鳥嘌呤的損失量。加入1ml反應(yīng)介質(zhì)中的8-羥基鳥嘌呤的量可利用損失率和反應(yīng)介質(zhì)中8-羥基鳥嘌呤的原始量來測定,酶活性可表達為在上述反應(yīng)條件下DNA底物中釋放出來的8-羥基鳥嘌呤的含量,數(shù)據(jù)可表達為6次實驗的均值±標準誤差。統(tǒng)計分析用t檢驗。

2 結(jié)果

KBrO3對82羥基鳥嘌呤糖基酶活性的影響效應(yīng)可通過腎與肝中含量的時間及劑量效應(yīng)來表達。為比較起見,腎臟被選作靶器官,肝臟作控制對比。圖1顯示腹膜內(nèi)給予80mgPkg劑量KBrO3后,兩種器官中82羥基鳥嘌呤含量的時間效應(yīng)關(guān)系,在腎臟,發(fā)現(xiàn)其活性在3h[(0.73±0.14)pmol]時顯著升高,相比之下,在0h活性只有(0.20±0.06)pmol,而在6h時,其活性達到高大值(1.25±0.14)pmol,該值是0時的6倍。然后,活性開始下降并在12h回到0h水平;作為對比,肝中活性在相同時間段并無顯著變化。圖2顯示其活性與KBrO3劑量的關(guān)系,不加處理時,活性只有(0.20±0.06)pmol,而在20、40、80及160mgPkgKBrO3腹膜下給予時,其活性分別是(0.33±0.09)、(0.53±0.10)、(0.75±0.13)及(1.30±0.08)pmol,在40mgPkg以上時活性顯著增高,且顯示劑量反應(yīng)關(guān)系,而肝中活性在相同的劑量范圍內(nèi)并無顯著變化。