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    Southern 雜交鑒定

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
    1) 取10ul待測DNA,于一定濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。(20mL,1.0%凝膠,)
    2) 凝膠用溴化乙錠染色,切掉凝膠四周多余部分,并在凝膠的一角作一記號, 拍照
    記錄電泳結(jié)果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。
    3) 雜交用膠的制備 (做以下步驟兩組合一)
    A. 將凝膠浸沒入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min,使DNA脫嘌呤。
    B.用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
    C.將凝膠浸沒入30mL變性液中30min, 使凝膠變性。
    D.將凝膠浸沒入30mL中和液中15min使它被中和。
    重復(fù)D一次。在制備雜交用膠時準備轉(zhuǎn)移的平臺、膜、濾紙等(4、5)。
    4) 準備DNA從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的平臺
    5) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉(zhuǎn)移膠相同大小,并在尼龍膜一角做一標記。
    另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度,長度(約18cm)足以達到轉(zhuǎn)移液盒子的底部。
    準備10 X SSC 轉(zhuǎn)移液。
    將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后,再浸入10 X SSC 轉(zhuǎn)移液中。
    6)安裝毛細管轉(zhuǎn)移裝置
    A.將長的濾紙放在轉(zhuǎn)移平臺的頂部,濾紙兩端達到轉(zhuǎn)移盒的底部,做成虹吸橋。
    B.將8 0mL轉(zhuǎn)移液倒入轉(zhuǎn)移盒內(nèi),并濕潤濾紙。
    C.將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上,凝膠與濾紙間避免有氣泡。
    D.用保鮮紙封住凝膠四邊。
    E.將浸濕的轉(zhuǎn)移膜置于凝膠的上部,凝膠與膜間避免有氣泡。
    F.將剩下的3張濾紙小心的放在轉(zhuǎn)移膜的上面,并放一疊吸水紙搭在濾紙上,再放一
    玻璃板,其上壓一重物。
    G.轉(zhuǎn)移幾小時或過夜(至少4小時)
    注意:勿使轉(zhuǎn)移液干枯。
    7)已轉(zhuǎn)移的DNA與膜交聯(lián)
    A.將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上,有DNA的一面朝上。
    B.將膜置于UV crosslinker 中,在紫外光下自動交聯(lián)。
    C.用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜,空氣中干燥。
    此膜可在4oC長期保存。
    8)DNA探針的制備(略過)
    參照生產(chǎn)商提供的實驗方法合成地高辛標記的探針。
    9)印跡的預(yù)雜交
    將適量的預(yù)雜交液DIG Easy Hyb在42 oC預(yù)熱。
    放入印跡膜,在42 oC預(yù)雜交30min。
    10)準備探針
    水煮地高辛標記的探針5min使變性, 并立即放在冰上2min.
    11) 加適量的探針到已預(yù)熱的雜交液中,混合均勻(避免形成泡沫,影響雜交效果)。
    42 oC雜交至少4小時或過夜。
    注意: 不要將探針直接加在印跡膜上,而應(yīng)加在容器一角的預(yù)雜交液中
    12)印跡膜的沖洗:
    A.將雜交液倒出,儲存起來可再次使用。
    B. 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室溫搖動洗膜2次,每次5min .
    C. 用已預(yù)熱的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC搖動洗膜2次,每次15min (用雜交爐).
    13)免疫檢測:
    A. 用10mL沖洗液洗膜1-5min.
    B. 膜在15mL阻斷液中孵育30min
    C. 膜和8mL抗體孵育30min
    D. 在15mL沖洗液中洗膜2次,每次15min.
    E. 在15mL檢測液中平衡2-5min.
    14)將膜的有DNA的面朝上,放在保鮮紙上,滴數(shù)滴CSPD ready-to-use 覆蓋膜; 然后,立即
    用保鮮紙包裹, 擠掉多余的CSPD ready-to-use,使其均勻平鋪在膜上,沒有氣泡, 但避
    免使膜干掉. 室溫孵育5min.
    15)在37 oC孵育潮濕的膜10min,增強發(fā)光.
    16)用X-光底片將雜交膜進行曝光10-25min.
    (發(fā)光性能至少可持續(xù)48小時)
    17) X-光底片的沖洗
    Agfa 30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾干底片
     

     

     
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