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    常用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹!

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-04-18  來源:網(wǎng)絡(luò)
    核心提示:常用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹。
    核酸分子雜交技術(shù)
    由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性,它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù),被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選,酶切圖譜的制作,基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針(probe,待測核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的,能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNARNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

     

    固相雜交
    固相雜交(solid-phase hybridization)是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)(硝酸纖維素膜或尼龍濾膜)上,再與探針進(jìn)行雜交,故也稱為膜上印跡雜交。

     

    斑步雜交(dot hybridization

    是道先將被測的DNARNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標(biāo)記好的DNARNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡單,事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品,可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測;根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果,可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測基因的相對(duì)分子質(zhì)量,而且特異性較差,有一定比例的假陽性。

     

    印跡雜交(blotting hybridization

    Southern印跡雜交:凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段,將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上,經(jīng)干烤固定,再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng),用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色,檢測特定大小分子的含量?蛇M(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析(RELP)等。

    Northern印跡雜交:Southerm印雜交法演變而來,其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后,轉(zhuǎn)移到固相支持物上,進(jìn)行雜交反應(yīng),以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法,可推臬出癌基因的表達(dá)程度。

     

    差異雜交(differential hybridization

    是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用兩種混合的不同cDNA探針(如:轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA)分別與濾膜上的DNA雜交,分析兩張濾膜上對(duì)應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物(如酵母)表達(dá)基因的比較,假陽性率較低。但對(duì)基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物(如人),則因工作量太大,表達(dá)的序列所占百分比較低(僅5%左右),價(jià)值不大。

     

    cDNA微點(diǎn)隈雜交(cDNA microarray hybridization

    是指將cDNA克隆或cDNAPCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上(如:尼龍膜或活化的載玻片)以微點(diǎn)陣,然后用混合的不同DNA探針與微點(diǎn)陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點(diǎn)陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低,適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點(diǎn)是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。

     

    寡核苷酸微點(diǎn)隈雜交(oligonucleotide microarray hybridization

    是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面,與平均長度為20-50nt的混合RNAcDNA探針進(jìn)行雜交,以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個(gè)數(shù)量級(jí)的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測,以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征,或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。

     

    液相雜交(solution hbridization

    指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈(探針)在溶液中保溫,使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后,用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開,然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量,就可推算出被測的核酸量。

     

    遞減雜交(subtractive hybridizatio

    是利用兩種來源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA(或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA,在一定的條件下以過量的驅(qū)動(dòng)mRNAcDNA與測試的單鏈cDNAmRNA進(jìn)行液相雜交,通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分,保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫,可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長序列。

     

    核酸原位雜交

    用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級(jí)或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對(duì)其實(shí)行檢測的方法,稱為核酸原位雜交(nucleic acid hybridization in situ)。用來檢測DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布,與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏;還用于細(xì)胞、組織中有無特異性菌、病毒檢測的研究。

    該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高,可精確定位;能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響;不需要從組織中提取核酸,對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性;并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究,如基因定位、基因制失,基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量,方法更為完善。

     

    DNA分子克隆技術(shù)(也稱基因克隆技術(shù))

    在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接,轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括:制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接,制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體(vecors)在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制,并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖,從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝,有了這些與親本分子完全相同的分子克隆,就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能,隨著引入的DNA片段不同,有兩種DNA庫,一種是基因組文庫(genomic library,另一種是cDNA庫。
     

    核酸序列測定

    DNA的堿基序列決定著基因的特性,DNA序列分析(測序,sequencing)是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因,最終均需進(jìn)行核酸序列分析,可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu),獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜,分析基因的突變及對(duì)功能的影響,幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物,以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等,近年來已有DNA序列自動(dòng)測定儀問世;瘜W(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素,然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解,在電泳和自顯影后,可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑,如:2`,3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(ddTTP、ddTTP、ddGTPddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長,與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng),這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段,經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影,可讀出合成的DNA核苷酸序列,根據(jù)堿基互補(bǔ)原則,可推算出模板DNA分子的序列。

    化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑,重復(fù)性好,容易掌握;而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶,便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用,合成的引物容易獲得,測序技術(shù)不斷改進(jìn),故此法已被廣泛應(yīng)用;撗醴ǖ淖詣(dòng)激光熒光測序儀,使測工作更快速和簡便,而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序,然后反推RNA序列

     

    聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

    聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù),是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù),可檢出微量靶序列(甚至少到1個(gè)拷貝)。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板,在一對(duì)引物介導(dǎo)下,在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100-200萬份拷貝。PCR反應(yīng)分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板,這樣經(jīng)過九小時(shí)的循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板,這樣經(jīng)過數(shù)上時(shí)的循環(huán)后,可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共進(jìn)行30次循環(huán)左右,最后再延伸725分鐘,4℃冷卻終止反應(yīng)。

    編輯:songjiajie2010

     
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