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革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典、最常用的鑒別染色法之一， 由丹麥細(xì)菌學(xué)家Christian Gram 首創(chuàng)。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭陽(yáng)性菌(G+ )，后者為革蘭陰性菌(G- )。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性復(fù)紅等進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭正反應(yīng)；弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同pH 條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反；所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；pH 很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫一碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽(yáng)性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；所以脫色時(shí)間、脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。
革蘭染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：涂片固定；草酸銨結(jié)晶紫染1 min，自來水沖洗；加碘液覆蓋涂面染1 min；水洗，用吸水紙吸去水分；加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30 S后水洗，吸去水分；復(fù)紅染色液(稀)染30 S后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。但在我們的實(shí)際染色結(jié)果中，特別是同學(xué)在初學(xué)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)一些錯(cuò)誤使染色結(jié)果與實(shí)際結(jié)果不一致。通過多年的教學(xué)實(shí)踐，我們總結(jié)出可能是以下幾方面的因素的影響。
1 操作因素
1.1 涂片太厚 在涂片時(shí)細(xì)菌挑的太多，沒法分開，在脫色時(shí)就不能將第一步染上的結(jié)晶紫的顏色脫去，可能會(huì)使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
1.2 脫色時(shí)間 陽(yáng)性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結(jié)果，如果延長(zhǎng)脫色時(shí)間，也會(huì)使脫色劑滲透進(jìn)陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上復(fù)紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短的話又會(huì)使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能完全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
1.3 固定方法 固定不僅能殺死細(xì)菌，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，還能使細(xì)菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細(xì)菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的同學(xué)將玻片在火焰上烤的太久，改變了細(xì)菌原有的通透性，會(huì)使細(xì)菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
2 細(xì)菌因素
2.1 細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間 細(xì)菌的典型形態(tài)、染色性是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取這時(shí)的細(xì)菌做革蘭染色可以反應(yīng)細(xì)菌的真實(shí)的染色性。如果細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，變成了老齡菌，染色性就會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
2.2 培養(yǎng)基的成分 一般認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細(xì)菌與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
3 染液因素
3.1 碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長(zhǎng)，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細(xì)菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
3.2 結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會(huì)使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會(huì)使革蘭陰性菌染成革蘭陽(yáng)性菌。
3.3 酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽(yáng)性菌染上的結(jié)晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當(dāng)酒精的濃度為70% 時(shí)，它的脫色能力最強(qiáng)，可能使革蘭陽(yáng)性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
綜上所述，影響染色的其他因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色，所以我們?cè)谌旧珪r(shí)要注意當(dāng)染色結(jié)果與預(yù)想的結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，要考慮到這些因素的影響。對(duì)同學(xué)來講重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)操作因素的影響，使他們?cè)谝婚_始學(xué)習(xí)革蘭染色，就認(rèn)真對(duì)待，養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)態(tài)度，嚴(yán)格按照操作規(guī)程來做，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
