放射性碘標(biāo)記
在RIA中,標(biāo)記抗原質(zhì)量的優(yōu)劣,直接影響測(cè)定結(jié)果,必須制備比放射性強(qiáng)、純度高的標(biāo)記抗原,并保持免疫活性不受喪失。
一、同位素的選擇
同位素有穩(wěn)定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時(shí)放出的放射線進(jìn)行測(cè)量,這種測(cè)量較靈敏而方便,故多用放射性同位素。標(biāo)記抗原,常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優(yōu)缺點(diǎn),可根據(jù)所進(jìn)行的放射免疫分析的類型特點(diǎn),標(biāo)記物制備和供應(yīng)情況以及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等作適當(dāng)?shù)倪x擇(表8-1)。大多數(shù)抗原分子中都含有C、H等原子,所以用14C或3H標(biāo)記不改變抗原的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性,且14C、3H半衰期長(zhǎng),所標(biāo)記的抗原長(zhǎng)時(shí)間放置后仍可使用,這都是其優(yōu)點(diǎn)。14C或3H標(biāo)記的不足之處是操作較繁瑣,并難以獲得高比放射性的標(biāo)記物;3H及14C放出的都是弱β射線,需用較昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)器方能獲得較高效率的測(cè)量,且測(cè)定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標(biāo)記容易喪失免疫化學(xué)或生物學(xué)活性者,則仍以采用3H或14C標(biāo)記物為佳。
表8-1 標(biāo)記抗原常用的放射性同位素及其性質(zhì)
放射性元素
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半衰期
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射線種類及能量(百萬(wàn)電子伏特)
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β
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γ
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14C
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5720年
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0.155
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-
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3H
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12.5年
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0.0189
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-
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125I
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60天
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-
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0.035
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131I
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8.05天
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0.608,0.335,0.250
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0.364,0.637,0.722
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大多數(shù)抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結(jié)構(gòu),往往容易損傷抗原的免疫化學(xué)活性;且放射性碘的半衰期較短,標(biāo)記物放置后因衰變使放射性降低,因而需要經(jīng)常制備標(biāo)記物或要求能定期提供放射性碘標(biāo)記都能適用,放射性碘放出γ—射線,用一般晶體閃爍計(jì)數(shù)器就能獲得較高效率而精確的測(cè)量,測(cè)量操作也很簡(jiǎn)單。由于這些突出的優(yōu)點(diǎn),目前在放射免疫分析中,使用放射性碘標(biāo)記物最多。
從應(yīng)用角度來(lái)看,131I和125I又各有其優(yōu)缺點(diǎn),可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規(guī)格等條件合理選用。但相對(duì)而言,125I有較多的優(yōu)點(diǎn),一是半衰期適中,允許標(biāo)記化合物的商品化及貯存應(yīng)用一段時(shí)間;二是它只發(fā)射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線,而無(wú)β粒子,因而輻射自分解少,標(biāo)記化合物有足夠的穩(wěn)定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對(duì)象(包括蛋白質(zhì)、肽類、固醇類、核酸類以及環(huán)型核苷酸衍生物等)的標(biāo)記,且操作簡(jiǎn)單,一般實(shí)驗(yàn)室都不難做到。
二、蛋白質(zhì)與多肽激素的放射性碘標(biāo)記
要制備高比度、高純度與免疫化學(xué)活性好的標(biāo)記物,首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標(biāo)記加網(wǎng)免疫分析的特異性,所以若用純度不高的抗原作標(biāo)記,則標(biāo)記后必須采取適當(dāng)?shù)牟襟E除去雜質(zhì),以獲得高純度的標(biāo)記物。標(biāo)記對(duì)象的純化應(yīng)盡量采用溫和的方法,否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(zhì)(這時(shí)表面上活性可能還是良好的),再經(jīng)標(biāo)記反應(yīng)時(shí)所受的損傷,活性就會(huì)顯著降低,影響以后的放射分析結(jié)果。有了好的純抗原,還要采用適當(dāng)方法加以標(biāo)記,盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學(xué)活性的標(biāo)記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關(guān)鍵問(wèn)題。
多肽激素與蛋白質(zhì)多用碘標(biāo)記,最常用的是125I。碘化反應(yīng)的基本過(guò)程如下:通過(guò)氧化劑的作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再與多肽激素、蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標(biāo)記法,標(biāo)記的化合物內(nèi)部必須有碘原子可結(jié)合的基團(tuán),即結(jié)構(gòu)上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質(zhì)、肽類等抗原,在結(jié)構(gòu)上含有上述基團(tuán)的可直接用放射性碘進(jìn)行標(biāo)記。如不含上述基團(tuán)的,放射性碘無(wú)法標(biāo)記,必須在這些化合物的結(jié)構(gòu)上連接上述基團(tuán)后才能進(jìn)行碘標(biāo)記。
因此影響蛋白質(zhì)、多肽碘化效率的因素,主要決定于蛋白質(zhì)、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反應(yīng)條件(pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間等)及所用氧化劑的性質(zhì)等也有影響。
常用的標(biāo)記方法有:
(一)氯胺T法
氯胺T法標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得,是目前使用最多的碘標(biāo)記方法。
1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一種溫和的氧化劑,在水溶液中產(chǎn)生次氯酸,可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個(gè)或兩個(gè)氫,使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。
2.方法以125I—AVP的制備為例。
。1)碘化反應(yīng):AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t 30μg/15μl0.05mol/l PB, pH7.5。迅速振蕩混勻,室溫下反應(yīng)40s。
。2)終止碘化反應(yīng):加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl0.05mol/l PB, pH7.5,以終止碘化反應(yīng)。
。3)Bio—Gel P2層析純化:將碘化反應(yīng)混合液注入Bio—Gel P2柱,用0.1n HAC溶液洗脫,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。
。4)放射性測(cè)量:測(cè)定各收集管的放射性,出現(xiàn)兩個(gè)峰,第一峰為125I—AVP,第二峰為游離碘鹽峰。第一個(gè)峰中計(jì)算最高的幾管,留下備用。
為了解標(biāo)記抗原的質(zhì)量,每次碘標(biāo)記后應(yīng)計(jì)算出碘的利用率,標(biāo)記上多少放射性碘,以及每微克抗原結(jié)合上多少放射性碘。
(5)標(biāo)記抗原的貯存:經(jīng)純化與檢查后的標(biāo)記物、加入1/8體積的異丙醇,分成若干小份,置于鉛罐中,在-20℃以下的冰箱中貯存?zhèn)溆,?yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)記抗原在貯存中是不穩(wěn)定的,這是因?yàn)椋阂皇敲摰猓瑯?biāo)記的碘從原來(lái)位置上脫落,變成游離碘;二是蛋白損傷、變性,成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明顯降低,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率變小,以致不能使用,故需分離純化,其方法是用Sephadex G100長(zhǎng)柱(40~80cm )過(guò)柱,洗脫后出現(xiàn)3個(gè)峰。第1個(gè)峰分子量大,是蛋白變性的聚合的大分子,尚保留部分抗原決定簇,免疫活性弱;第2個(gè)峰是純抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3個(gè)峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰,免疫活性好;第3個(gè)峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰,其性能類似于新鮮標(biāo)記的抗原。分離純化的方法解決了標(biāo)記抗原的貯存、長(zhǎng)期使用問(wèn)題,特別對(duì)來(lái)之不易的抗原更顯得重要。
2.注意事項(xiàng)
(1)放射性碘源的選用:無(wú)載體的131I或125I均可用于碘化標(biāo)記,但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否則加入碘源的容量要增加,隨著帶入碘源中含有的還原劑(為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入)量也增加,這將會(huì)顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源,一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低,另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多(主要是131I源),都會(huì)降低標(biāo)記時(shí)的碘利用率。放射性碘源含還原劑(如Na2S2O5等)量多時(shí),會(huì)抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無(wú)載體的,標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘;只要有極少量的碘的污染,非放射性碘就會(huì)稀釋放射性碘,使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染,以及減少射線對(duì)蛋白質(zhì)分子的損傷,標(biāo)記投入的放射碘量不宜過(guò)大,一般以<5mCi為宜。
(2)放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例:這比例對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因,一般標(biāo)記時(shí)放射性投入量不宜過(guò)多,示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1~2mCi,因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時(shí)投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來(lái)控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時(shí),多肽、蛋白質(zhì)用量多(即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低),能獲得高碘利用率,但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低;相反多肽、蛋白質(zhì)用量少(即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高),則碘利用率降低,但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動(dòng);而當(dāng)此比值<1后,則碘利用率再下降的幅率較小,標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會(huì)再增加多少。
。3)氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時(shí)間:氧化碘化標(biāo)記法中,會(huì)導(dǎo)致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑,早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時(shí)氯胺T用量都比較大,或碘化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng),結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大,或長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行碘化反應(yīng),結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少,反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時(shí),試以各種蛋白質(zhì)(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等)作微量標(biāo)記,當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0~20。C反應(yīng)20s,碘利用率都已接近或達(dá)到最大峰,再加大氯胺T用量和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間是沒(méi)有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多,氯胺T用量也應(yīng)增加,以達(dá)到預(yù)期的碘利用率,但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長(zhǎng)碘化反應(yīng)時(shí)間(通常反應(yīng)時(shí)間不要超過(guò)1min),否則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活,不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然,減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上,否則碘源中還原劑量較多,雙盲目減少氯胺T用量,就會(huì)使標(biāo)記失敗。一般用125I標(biāo)記時(shí),氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻,以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。
氯胺T用量減少了,Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時(shí)終止碘化反應(yīng),實(shí)驗(yàn)時(shí)加入Na2S2O5一般都是過(guò)量的。氯胺T用量大時(shí),加入Na2S2O5的剩余量也就會(huì)隨之增加,這就可能加重某些對(duì)還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此,Na2S2O5用量也不應(yīng)過(guò)多。只要藥品沒(méi)有變質(zhì)、試劑是新配的,以重量計(jì)算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)(按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算,Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4),不要盲目加大用量,并應(yīng)迅速將標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來(lái),以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。
某些蛋白質(zhì)或多肽對(duì)氯胺T較敏感,還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度,以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對(duì)一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。
(4)碘化反應(yīng)體積:系指加入Na2S2O5終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小,局部反應(yīng)物濃度愈高,所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以,標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少(<0.2~0.3ml)時(shí),反應(yīng)體積對(duì)碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大;當(dāng)反應(yīng)液量大(>0.5~1.0ml)時(shí)則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時(shí),一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。
(5)碘化反應(yīng)溫度:溫度升高,碘化反應(yīng)速度加快,碘利用率有所增加。但總的來(lái)看,反應(yīng)溫度的影響不很大,一般從0℃到20℃碘利用率相差不過(guò)百分之幾,故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性,則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。
。6)碘化反應(yīng)的pH值:受氧化劑氧化生成的活性碘,對(duì)多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用,最適pH是7.3~7.8之間。當(dāng)pH變化時(shí),碘化位置也會(huì)發(fā)生變化,例如pH值較高時(shí),組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化;當(dāng)pH4~5時(shí),活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚,導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng),或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時(shí),除放射性碘源外,所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制,保證碘化反應(yīng)在最佳pH條件下進(jìn)行。
(7)微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失:界面的吸附損失,在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時(shí)是可以忽略的,但作微量法標(biāo)記時(shí)投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時(shí),所用ACTH濃度低到50Pg/ml時(shí),因表面吸附可損失10%~30%,甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時(shí),能減少吸附,但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%~8%、殘留在層析柱上折占5%~10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線增減,殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見(jiàn),微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會(huì)被顯著吸附而丟失,所以標(biāo)記時(shí)投入蛋白質(zhì)、多肽量過(guò)微(如<2μg)也是不適宜的,否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會(huì)太低,并在計(jì)算上會(huì)造成較大的誤差。
。8)不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別:由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同,而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同,分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng),有的就不容易碘化,因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記,不同蛋白質(zhì)或多肽對(duì)碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素(GRH)、促黃體激素釋放激素(LRH)等多肽,碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性;而AFP及人絨毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化標(biāo)記,則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。
盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別,但上述討論的因素對(duì)不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素,就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。
不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同,放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后,可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)(或多肽)與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開(kāi),常用的方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。
。ǘ┤檫^(guò)氧化物酶法(LPO)
本法反應(yīng)溫和,對(duì)抗原、抗體免疫活性影響小,已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低,一般為20~40%。
1.原理此法是利用乳過(guò)氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進(jìn)微量過(guò)氧化氫對(duì)125I-的氧化作用,生成125I+,并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。
2.方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。
。1)反應(yīng)液組成:蛋白質(zhì)2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci10μl、乳過(guò)氧化物酶溶液25ng10μl、H2O2200ng10μl;
(2)在室溫保溫7min;
(3)加入H2O2200ng10μl;
。4)過(guò)7min再加入H2O23μl;
。5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng);
。6)10min后加入NaI載體溶液1ml ;
(7)按常規(guī)方法分離純化。
3.注意事項(xiàng)
(1)LPO質(zhì)量好壞,可直接影響標(biāo)記率,LPO應(yīng)在使用前新鮮配制,以防酶活性降低。
。2)LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%,以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。
(3)碘化反應(yīng)速率分析表明,酶的催化速度很快。
(4)碘化反應(yīng)在pH4.0~8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行,最適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。
。5)H2O2應(yīng)保持低濃度,如高于0.1mmol/L,對(duì)酶的活性將有抑制作用。
。ㄈ㊣odogen碘化法
此法具有標(biāo)記率高、反應(yīng)體積。3ml水平)、可用低濃度的125I原料、對(duì)多肽激素和蛋白質(zhì)的免疫活性損失小、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),系常規(guī)的碘化方法之一。
1.原理 用Iodogen為氧化劑,對(duì)蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記,把125I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記過(guò)程中被標(biāo)記樣品不與Iodogen混合,標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng),不使用任何還原劑。
2.方法
(1)標(biāo)記之前,先把Iodogen溶于有機(jī)溶劑,涂于管底,并使之干燥。
(2)標(biāo)記時(shí),將蛋白質(zhì)溶液10~20μg/10μl0.5mol/L,pH7.5PB置于反應(yīng)管中,反應(yīng)管置于冰浴中。碘化時(shí),125I與蛋白質(zhì)克分子之比例為1~1.2。反應(yīng)時(shí)間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達(dá)10min,從反應(yīng)管中轉(zhuǎn)移出反應(yīng)混合液,使其反應(yīng)停止。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中,層析分離前再放置5min,使其未標(biāo)記的碘離子還原成分子碘,以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。
3.注意事項(xiàng)
。1)涂有Iodogen的反應(yīng)管,有氮?dú)庵忻芊,并貯存在-20℃條件下,至少可用3個(gè)月。打開(kāi)管,使用時(shí)間很短。
。2)碘化反應(yīng)時(shí)間,7min時(shí)標(biāo)記率達(dá)最高,10min時(shí)略有減少。PH6.0~8.5時(shí),標(biāo)記率最高。
。3)Iodogen與蛋白質(zhì)的比率是標(biāo)記率的函數(shù)。最大的標(biāo)記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。
(四);噭˙olton和Hunter試劑)法
1.原理這個(gè)方法用;瘎3--(4-羥苯基)丙酸—N琥珀酰胺酯(Bolton—Hunter試劑)做連接試劑,將125I標(biāo)記在羥苯基的2,5位置上,再將琥珀酰胺酯水解,通過(guò)一個(gè)酰氨鍵將3--(4—羥基—5—125I—苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。
2.方法125I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備,出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時(shí)取一定量的標(biāo)記酯(μmol 蛋白用3~5μmol標(biāo)記酯),用氮?dú)獯党,投入欲?biāo)記蛋白5~10μg及緩沖液10~50μl,pH8.0~8.5為宜,在冰浴中反應(yīng)15~30min后,加入多量氨基酸(如甘氨酸),使過(guò)量標(biāo)記酯消耗掉以終止反應(yīng)。
此法避免了蛋白質(zhì)與氧化劑的接觸,又避免了與放射性碘原子的直接接觸,可防止碘源中有害物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷,適用于標(biāo)記缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)或酪氨酸在活性中心,引入碘原子后會(huì)引起蛋白質(zhì)的失活。其缺點(diǎn)是標(biāo)記技術(shù)比較復(fù)雜,需要接觸較多的放射性,經(jīng)二步反應(yīng),碘標(biāo)記率比較低。一般認(rèn)為此法不宜標(biāo)記短肽,而適于分子量大于1萬(wàn)的蛋白質(zhì)。
三、放射性標(biāo)記化合物的純化與鑒定
。ㄒ唬┘兓瘶(biāo)記化合物的常用方法
不論使用何種制備方法,要獲得合格的標(biāo)記化合物,都必須將反應(yīng)物經(jīng)過(guò)仔細(xì)的分離、純化。另外,一些標(biāo)記化合物,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的存放后,往往會(huì)出現(xiàn)不純物,而需再純化。如碘標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125--HGH),在剛標(biāo)記的第2天,從Sephadex G-100過(guò)濾譜上可見(jiàn),幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II;保存1個(gè)月后,峰II組份減少,峰I和峰III成分明顯增加,峰I是集聚的標(biāo)記生長(zhǎng)激素,而峰III是不具有免疫活性的放射性化學(xué)雜質(zhì)(圖8--3)。
圖8-3 125I—HGH的Sephadex G-100過(guò)濾譜
實(shí)線:新鮮制備的 125I—HGH 虛線:保存1個(gè)月的125I—HGH
標(biāo)記化合物的純化方法,除制備比活度低而化學(xué)量又較多的標(biāo)記物可用重結(jié)晶、蒸餾、萃取等常規(guī)方法外,一般需用微量分離技術(shù),較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過(guò)濾及高效液相層析法等。現(xiàn)以碘標(biāo)記蛋白為例,說(shuō)明以上各種方法的適用情況。
1.凝膠過(guò)濾法常用的是Sephadex G系列,也有Biogel—P系列。分離標(biāo)記蛋白與無(wú)機(jī)碘時(shí),通常用Sephadex G—25或G—50,然后用G—100進(jìn)一步純化。
2.離子交換法一般是制成離子交換層析柱,用于分離純化短肽標(biāo)記物。
3.透析法 能將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離。
4.電泳法可用來(lái)分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)。
5.親和層析法利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來(lái)分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)。此法特異性強(qiáng),保持生物活性好,但操作較復(fù)雜。
6.高效液相層析法此法最大優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、快速,但需特殊設(shè)備。
7.伴刀豆球蛋白A(ConA)吸附法ConA是一種植物凝集素,對(duì)糖蛋白有良好吸附能力,因此適于分離標(biāo)記糖蛋白。吸附的標(biāo)記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。
。ǘ(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)
作為示蹤劑及分析試劑的標(biāo)記化合物,應(yīng)具有比一般非標(biāo)記化合物更高的質(zhì)量要求。標(biāo)記化合物的質(zhì)量指標(biāo)包括:放射性核純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標(biāo)記位置和定量分布情況等。
1.放射性核純度及其檢查方法
。1)放射性核純芳可用下式表示:
放射性核純度(%)=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100
(2)放射性核純度的檢查方法:每一種核素都有它的特征,即物理半衰期及射線能量,故可通過(guò)半衰期及射線能量的測(cè)定來(lái)鑒別所需放射性核的純度。
、贉y(cè)定半衰期法:如短半衰期放射性核素,一般可采用時(shí)間跟蹤法,每隔一定時(shí)間測(cè)量放射性一次,共測(cè)3~5個(gè)半衰期,以每次測(cè)得的放射性計(jì)數(shù)為縱座標(biāo),時(shí)間為橫座標(biāo),在半對(duì)數(shù)紙上作圖,并通過(guò)分析,可求出該放射性核素的純度。
、跍y(cè)定射線能量法:利用每一放射性核素的特征射線譜來(lái)檢查放射性核純度。γ發(fā)射體可用γ能譜儀,如檢測(cè)57Co和58Co的核純度:純β-發(fā)射體可用液閃儀,調(diào)節(jié) 道寬及淬火校正后,對(duì)如3H、14C、32P的核純度進(jìn)行測(cè)量;而β、γ混雜垓素,則用吸收法測(cè)量,如99mrTc中母體雜質(zhì)99mMo的含量測(cè)量,是通過(guò)適當(dāng)厚度的鉛屏蔽,將99mTc 發(fā)射的能量為141ke V的γ射線減弱后,測(cè)定99Mo發(fā)射的能量為739Kev 的γ射線。
2.放射化學(xué)純度及放化純度鑒定
。1)放射化學(xué)純度:放射性核素標(biāo)記化合物都是以一定的化學(xué)形態(tài)存在的,所以:
放射化學(xué)純度(%)特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100
放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)物存放條件等影響,一般放化純度控制在95%以上。
。2)放射化學(xué)純度的測(cè)定方法:原則是高效的化學(xué)分離與靈敏的放射性測(cè)量相結(jié)合。常用下列方法:
、俜派鋵游龇,又稱放射色譜法:本法是利用色譜技術(shù)使混合物中各組份分離,然后測(cè)定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。最常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。
、诜派湫愿咝б合鄬游龇ǎ核鼘(duì)分離純化標(biāo)記化合物及鑒定標(biāo)記化合物的放化純度都有很大潛力,具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點(diǎn)(幾乎80%的有機(jī)化合物均可應(yīng)用)。關(guān)鍵是要選擇合適的固定相和流動(dòng)相,使產(chǎn)品與雜質(zhì)分離。在流動(dòng)相中,被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè),而其放射性活度,可同時(shí)由放射性探測(cè)儀測(cè)定。放射性活度測(cè)定最簡(jiǎn)單的一種辦法,是將洗脫液分部收集,然后在γ儀或液閃儀上進(jìn)行測(cè)量;另一種較理想的是連續(xù)測(cè)量,在洗脫液流通池外包圍一個(gè)固體閃爍探頭,進(jìn)行γ計(jì)數(shù)或在流通池前加一個(gè)三通混合室,用另一個(gè)泵混入閃爍液,測(cè)定軟β射線?梢耘c紫外控測(cè)器的掃描圖,同步描繪出放射性的分布圖。
、鄯派湫院怂胤聪♂尫ǎ喝∫欢浚╓1)已測(cè)定比活度(SO)的標(biāo)記化合物(約0.1~10mg),用>1000倍化學(xué)量(W2)的純載體稀釋,充分混勻后反復(fù)純化到比活度恒定不變(Sp),此標(biāo)記化合物的放化純度值應(yīng)為:
有時(shí)該值>100%時(shí),往往是由于所用載體化學(xué)純度不夠。因本法操作要求嚴(yán)格,一般不作常規(guī)放化純度鑒定用。
3.化學(xué)純度及化學(xué)量的測(cè)定標(biāo)記化合物中的非放射性化學(xué)雜質(zhì)雖一般不會(huì)對(duì)示蹤結(jié)果帶來(lái)直接干擾,然而這種雜質(zhì)的含量越多對(duì)標(biāo)記化合物在使用、存放過(guò)程中分解、變性的影響就越大。此外,也已發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)給使用帶來(lái)直接影響。如用氚標(biāo)記類固醇作放射免疫分析試劑,其中的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)影響標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率,使分析靈敏度降低。因此,對(duì)標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)含量,同樣必須加以控制。
要制得化學(xué)純度的標(biāo)記化合物,最好是對(duì)可能產(chǎn)生的雜質(zhì)加以防止。這要在冷試驗(yàn)中解決。因?yàn)槔湓囼?yàn)所得產(chǎn)品是非放射性的,其化學(xué)純度可用常規(guī)方法,如溶點(diǎn)、沸點(diǎn)測(cè)定,NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定,得到合格產(chǎn)品后,再按同樣方法及條件進(jìn)行標(biāo)記制備。
對(duì)于標(biāo)記化合物的化學(xué)含量,則必需在標(biāo)記反應(yīng)及一定純化步驟后進(jìn)行,由于需要高比活度的標(biāo)記化合物,往往樣品的放射性很強(qiáng),而化學(xué)量極微(如某氘標(biāo)記化合物,分子量為300,每分子上標(biāo)記2個(gè)氘原子,氘的同位素活度為99.8%,則理論上每25mCi(925MBq)的化學(xué)量還不足(130μg),所以需用微量分析法才能測(cè)定其含量。一般而言,各種常規(guī)微量分析技術(shù)均可應(yīng)用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進(jìn)行含量測(cè)定。
4.放射性比活度及其測(cè)定
。1)放射性比活度簡(jiǎn)稱比活度,過(guò)去也稱比放射性。
比活度=放射性活度/單位化學(xué)量
(2)比活度的理論值計(jì)算:每種放射性核素有一個(gè)比活度理論值,取決于該核素的半衰期和衰變常數(shù)。若N是1毫克原子(1mA)的總原子數(shù),衰變常數(shù)λ(單位時(shí)間衰變的%),則
任何元素每1mA的原子數(shù)都相同,等于阿伏加德羅常數(shù),即6.023×1020個(gè),故
若T1/2min為單位,則上式的活度單位為dpm/mA,進(jìn)行單位換算后為:
根據(jù)上式,可計(jì)算出每種放射性核素比活度的理論值(常用放射性核素的比活度理論值見(jiàn)表8-2)。如果標(biāo)記化合物每分子接上一個(gè)放射性核素原子,則以上原論值亦為該標(biāo)記化合物的比活度(每毫摩爾的活度)理論值。
表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值
。ㄒ嗉疵糠肿右唤右粋(gè)該放射性核素原子的標(biāo)記化合物的經(jīng)活度理論值)
放射性核素
|
半衰期
|
比活度理論值(每mA或mmol的活度)
|
14C
|
5730年
|
0.0624 Ci 2.3 GBq
|
3H
|
12.33年
|
29.0 Ci1073 GBq
|
45Ca
|
165天
|
793 Ci 29.3 TBq
|
75Se
|
118.5天
|
1100 Ci40.7 TBq
|
35S
|
87.4天
|
1494 Ci 55.2 TBq
|
125I
|
60.2天
|
2196 Ci80.3 TBq
|
131I
|
8.04天
|
16240 Ci 600 TBq
|
3放射性比活度測(cè)定方法
①直接測(cè)定計(jì)算法:將標(biāo)記產(chǎn)品經(jīng)分離純化后,配成合適的溶液,測(cè)定每毫升的放射性活度(如mCi/ml)及含量(μg/ml)從而計(jì)算其比活度。對(duì)于高經(jīng)活度的標(biāo)記物,化學(xué)含量甚低,一般需用光譜法,如紫外分光光度法測(cè)定其含量。
、趯游鰭呙杳娣e計(jì)算法:一般應(yīng)用紙層析或薄層層析,將反應(yīng)結(jié)果尚未分離的反應(yīng)液點(diǎn)樣、展層,然后在掃描儀上描繪放射性分布圖,根據(jù)描繪的面積來(lái)進(jìn)行計(jì)算,如圖8-4。
圖8-4 放射層析掃描面積計(jì)算比活度示意圖
1為標(biāo)記物峰面積:
S2S3為雜質(zhì)峰及放射性原料峰面積
先計(jì)算標(biāo)記率:
放射性比活度的計(jì)算:若投入的待標(biāo)記物重量為W,且100%轉(zhuǎn)化為標(biāo)記物,則比活度=A·Y/W,其中A為投入的總放射性。
如果層析掃描儀有紫外監(jiān)測(cè)器和放射性活度計(jì)數(shù)率儀可同步測(cè)定掃描,則直接可給出比活度。
、圩陨砣〈(jì)算法:這是間接測(cè)定標(biāo)記物比活度的方法。所測(cè)定的標(biāo)記物,需是分離純化后可用于RIA或RRA標(biāo)記試劑。
方法的原理是:作一條常規(guī)的RIA(或RRA)標(biāo)準(zhǔn)曲線,另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品,只加抗體和不同量標(biāo)記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體,且抗體用量完全相同。若反應(yīng)平衡后測(cè)定結(jié)合部分的放射性,掏算成所加總放射性(注意:對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線總說(shuō)總放射性各管相同,對(duì)自身取代曲線來(lái)說(shuō)各管不同,需分別換算)的百分?jǐn)?shù),即結(jié)合率B。由于兩條曲線所用抗體的質(zhì)和量嚴(yán)格相同,標(biāo)記物與非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品與抗體親和力也相同,故B的大小就完全取決于各管中標(biāo)記物和非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的總量。亦即若從兩標(biāo)準(zhǔn)曲線上取一點(diǎn)相同的B,則
(標(biāo)記物+標(biāo)準(zhǔn)品)標(biāo)準(zhǔn)曲線=(標(biāo)記物)自身取代曲線
故由此便可直接計(jì)算標(biāo)記試劑的化學(xué)含量并進(jìn)一步求得比活度。為求準(zhǔn)確度高,可取我點(diǎn)B求出平均比活度。
用自身取代法測(cè)定標(biāo)記化合物的比活度,只適用于RIA的標(biāo)記抗原及受體的標(biāo)記配基。使用時(shí)應(yīng)注意:①標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體(受體)的親和力應(yīng)相同;②非特異性結(jié)合應(yīng)較小,且計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除;③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身取代曲線時(shí),操作步驟應(yīng)相同,特別是B與F分離的條件要一致。
5.生物活性、免疫活性測(cè)定
。10)生物活性、免疫活性測(cè)定的重要性:放射性標(biāo)記化合物作為示蹤劑用于生物體內(nèi)的示蹤研究,或作為分析試劑用于生物活性物質(zhì)分析,都要求標(biāo)記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當(dāng)給化物引入放射性原子,即使“同位素標(biāo)記”大多需經(jīng)過(guò)原子交換或化學(xué)反應(yīng)及分離純化等物理化學(xué)處理,有可能造成光學(xué)構(gòu)型及立體構(gòu)型的改變而使標(biāo)記物改變性質(zhì)。“非同位素標(biāo)記”,如蛋白質(zhì)分子中引入碘原子,則更易引起蛋白質(zhì)失活、變性。故測(cè)定放射性標(biāo)記化合物的生物活性和免疫活性,對(duì)保證使用效果十分必要。
。2)生物活性和免疫活性測(cè)定的要求:需根據(jù)使用要求而定,因?yàn)橥粯?biāo)記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關(guān);同一標(biāo)記激素,其與受體結(jié)合能力的改變與抗體結(jié)合能力的改變也不一定平行。
(3)測(cè)定方法:測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種:
、傥锢砘瘜W(xué)方法:可用電泳法、吸附法及凝膠過(guò)濾法等物理化學(xué)方法來(lái)測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況,如標(biāo)記后受損全傷的蛋白質(zhì)在電泳時(shí)泳動(dòng)性減少,碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質(zhì)也有改變,而蛋白質(zhì)變性聚合時(shí)大分子聚合體將在凝膠過(guò)濾時(shí)不停留在凝膠柱上。這些測(cè)定雖較快速方便,但對(duì)標(biāo)記物的生物活性和免疫活性的嚴(yán)格判定來(lái)說(shuō),還是很不夠的。
、谔禺惤Y(jié)合試驗(yàn):根據(jù)放射性標(biāo)記化合物用于放射免疫分析等不同要求,分別與其相應(yīng)抗體或受體進(jìn)行特異性結(jié)合試驗(yàn)。以放射免疫分析試劑為例,測(cè)定其免疫活性的方法是:先觀察標(biāo)記物與抗體的結(jié)合率,如果結(jié)合率高,說(shuō)明抗原的免疫活性較好。進(jìn)一步觀察標(biāo)記抗原與非標(biāo)記對(duì)抗體親合力是否一致,做法之一是用不同稀釋度的抗體,分別與標(biāo)記抗原及與標(biāo)記抗原加非標(biāo)記抗原的混合物進(jìn)行特異結(jié)合,其中混合物抗原總濃度要和單獨(dú)使用放射性抗原的濃度相同。如單獨(dú)使用標(biāo)記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng,其中標(biāo)記抗原為0.1ng,非標(biāo)記抗原為0.9ng,比較兩者的結(jié)合率,如果基本相同,說(shuō)明標(biāo)記抗原保持其原來(lái)的親和力,在標(biāo)記等操作過(guò)程中未受到明顯損傷。如圖8-5中,A線與B線基本平行;如果標(biāo)記抗原免疫活性已有降低,則如C線所示。
圖8-5 標(biāo)記蛋白的免疫活性測(cè)定
A;為標(biāo)記抗原與血清的滴度曲線B:為非標(biāo)記抗原(加入少量標(biāo)記抗原)的滴度曲線;C:與A相同,但標(biāo)記抗原免疫活性已有降低
、凵锾匦詼y(cè)定:如125I—纖維蛋白原,可用凝血酶測(cè)定其可凝能力,與非標(biāo)記物相比,視是否有改變。使用何種生物特性測(cè)定,根據(jù)標(biāo)記物的生物性質(zhì)而定。另外,上述特異性結(jié)合試驗(yàn),如果受體作異結(jié)合劑,也是檢驗(yàn)用作RRA或RBA分析試劑的標(biāo)記物生物活性情況的有效方法。