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紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖
免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。
由于操作步驟比較多，同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個完美的免疫熒光實驗結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對實驗條件進行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴謹?shù)膶嶒瀸φ铡？傊�，免疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質(zhì)量，才能最終達到你的實驗?zāi)康摹?br />
基本實驗步驟：
（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎�。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
（5） 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6） 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
（一）細胞準備
用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
（二）固定和通透
除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂；
③使標本易于保存。
標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內(nèi)的抗原；
②不能凝集蛋白質(zhì)；
③應(yīng)保持細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)；
④固定后應(yīng)保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結(jié)合。
常用的固定劑有多種，應(yīng)根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)和所使用的抗體特性選擇適當?shù)墓潭▌�。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯(lián)劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細胞脫水，同時將細胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的結(jié)構(gòu)，但因為交聯(lián)阻礙抗體結(jié)合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結(jié)構(gòu)抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果，而細胞膜相關(guān)組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。
通透步驟只在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結(jié)果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關(guān)抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
（四）抗體孵育
直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進行。
（五）封片及熒光觀察
標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。
（六）標本保存
由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標本的 保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現(xiàn)，熒光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以采取權(quán)宜的辦法，比如固定標本片后低溫保存，在需要時再進行熒光標記，即隨用隨染。
