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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
1.掌握T淋巴細(xì)胞E花環(huán)試驗(yàn)的原理、正常值，了解其方法和用途。
2.熟悉光鏡下E花環(huán)的形態(tài)和計(jì)數(shù)方法。
實(shí)驗(yàn)原理
T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實(shí)E受體是人類T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細(xì)胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀。通過花環(huán)形成檢查T細(xì)胞的方法，稱為E花環(huán)形成試驗(yàn)。根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測(cè)知T細(xì)胞的數(shù)目，從而間接了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，判斷疾病的預(yù)后，考核藥物療效等。
實(shí)驗(yàn)材料
1.肝素抗凝靜脈血、Hanks液、小牛血清、淋巴細(xì)胞分離液、1%綿羊紅細(xì)胞懸液、0.8%
戊二醛、瑞氏染液
2.吸管、毛細(xì)滴管、玻片、試管、水平離心機(jī) 、顯微鏡
實(shí)驗(yàn)方法
（一）淋巴細(xì)胞的分離
1.取2～3ml肝素抗凝靜脈血（加肝素200U/ml抗凝），用Hanks液稀釋1倍，混勻。
2.取2～3ml淋巴細(xì)胞分離液加入15mm×150mm試管 中。
3.用毛細(xì)滴管吸取稀釋血液，在距分離液面上1cm處，沿管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液上（盡量避免沖入分層液中）。稀釋血液與分層液體積比為2∶1。
1.2000轉(zhuǎn)/分，水平離心20分鐘，小心取出試管 ，結(jié)果見圖。
2.用毛細(xì)吸管輕輕插到血漿與分離液的界面層，沿試管壁周緣吸出富含淋巴細(xì)胞的灰白色層即單個(gè)核細(xì)胞層，移入另一試管中。
3.加入5倍以上體積的Hanks液混勻，離心1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，棄上清液，將沉淀細(xì)胞振搖重懸后加Hanks液同法洗滌2次。
4.最后用營(yíng)養(yǎng)液配制成1～2×106/ml細(xì)胞懸液。
（二） E花環(huán)形成試驗(yàn)
1． 取上述淋巴細(xì)胞懸液加入等量1%綿羊紅細(xì)胞懸液、0.1ml小牛血清，混勻。
37℃水浴 5分鐘，500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，放4℃冰箱20分鐘。
2． 棄去適量上清，輕輕搖勻，加0.8%戊二醛1滴，混勻后置4℃冰箱15分鐘。
3． 取出后輕輕混勻涂片，自然干燥。
4． 瑞氏染色，將瑞氏染液加于玻片上先染1分鐘，再滴以等量的蒸餾 水，輕輕晃動(dòng)混勻，繼續(xù)染5分鐘水洗，干后鏡檢。
結(jié)果觀察
油鏡檢查：淋巴細(xì)胞呈藍(lán)色，SRBC呈紅色圍繞淋巴細(xì)胞形成花環(huán)，凡表面粘附有3個(gè)或3個(gè)以上SRBC者為花環(huán)形成細(xì)胞（即E陽性細(xì)胞）。
計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，算出花環(huán)形成百分率，并推測(cè)其T淋巴細(xì)胞百分率。正常值為：50～80%。
注意事項(xiàng)
1． 向分離液管加血液時(shí)應(yīng)沿試管 壁緩緩加入，使血液與分離液形成明顯的界面，小心放取試管 ，避免打亂界面，影響分離效果。
計(jì)數(shù)及搖勻細(xì)胞時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免打散已形成的花環(huán)
