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一. 影響顯色反應(yīng)的因素及反應(yīng)條件的選擇
(20)
(21)
（一）顯色反應(yīng)的選擇
1. 選擇性好：干擾少或易排除；
2. 靈敏度高（S）：尤其是對低含量組分，一般選擇 e：104 ~ 105 L/mol·cm
3. 有色化合物穩(wěn)定、組成恒定
4. 有色化合物與顯色劑的顏色差別大
（二）影響顯色反應(yīng)的因素及反應(yīng)條件
1. 顯色劑的用量
M + R ⇌ MR
待測組分 顯色劑 有色化合物
在被測組分一定及其它實驗條件不變的情況下，分別測得加入不同量顯色劑測得A值，作A-cR曲線，常見以下二種情況：圖7 吸光度與顯色劑加入量的關(guān)系
(a)
在 a 與 b之間任選一點
吸光度與顯色劑加入量的關(guān)系
(b)
嚴格控制CR
因此，合適的 cR 通過實驗確定。2. 溶液的酸度
(1) 對金屬離子存在狀態(tài)的影響——防止水解，防止沉淀生成
(2) 對顯色劑濃度的影響 H2R ⇌ 2H+ + R2-
(3) 對顯色劑顏色的影響
pKa pKa
H2R ⇌ H+ + HR- ⇌ 2H+ + R2-
6.9 12.4
黃 橙 紅適宜的 pH 通過實驗確定：做 A- pH 曲線（其它條件并不變），從中找出 A 較大且基本不變的某 pH 范圍。
3. 顯色時間：各種顯色反應(yīng)得速度不同，反應(yīng)完全所需時間不同；有些有色化合物在一定的時間內(nèi)穩(wěn)定。
選擇方法：作 A-t（min） 曲線，選擇在 A 較大且穩(wěn)定的時間內(nèi)進行。
4. 顯色溫度：顯色反應(yīng)一般在室溫下進行，但反應(yīng)速度太慢或常溫下不易進行的顯色反應(yīng)需要升溫或降溫。
選擇方法：作 A-T （℃）曲線，選擇在 A 較大的時間內(nèi)進行。
5. 溶劑：實驗確定——選擇合適的溶劑（常為有機溶劑），提高反應(yīng)的靈敏度及加快反應(yīng)速度。
二. 分光光度法測量誤差及實驗條件的選擇
（一）測量誤差及 A 范圍的選擇
任何一臺分光光度計都有光度誤差 ∆T%，但給定的一臺分光光度計， ∆T 基本上是一常數(shù)，一般為 ±0.002 ~ ± 0.01，但在不同 T 時同樣的 ∆T 對應(yīng)的 ∆A 則不同，所以引起的∆C/C (濃度的相對誤差)就不同。
由 L-B 定律得：
(20)
將此式微分得：
濃度相對誤差為：
(21)
設(shè) 當(dāng) ∆T = ± 0.01時 ，不同 T% 時所對應(yīng)的 ∆c/c 可從相關(guān)表查得：
當(dāng) T% = 36.8% 即 A = 0.434時， ∆c/c 最��；
當(dāng) T% 在 15-65% 之間 即 A 在0.2 ~ 0.8范圍內(nèi)，∆c/c 較小。
實際測定時：可通過控制溶液的 c 及 b 使 A 在 0.2 ~ 0.8 范圍內(nèi)。
（二）測量波長選擇
一般根據(jù)吸收光譜選擇 lmax 測定——靈敏度高、A 隨波長變化小若有干擾，根據(jù)“吸收大，干擾小”原則選擇l 。
如：3，3’-二氨基聯(lián)苯（DAB）和 Se 形成配合物 Se-DAB 的最大吸收波長在340nm波長處，DAB也有很強的吸收，在這種情況下，分析波長應(yīng)選用次大吸收波長420nm，否則測量誤差較大。
3. 狹縫寬度
理論上，定性分析采用最小的狹縫寬度，在定量分析中，為避免狹縫太小，出射光太弱而引起信噪比降低，可以將狹縫開大一點。通過測定 A 隨狹縫寬度的變化規(guī)律，可選擇出合適的狹縫寬度。狹縫寬度在某個范圍內(nèi)，A 值恒定，狹縫寬度增大至一定程度時 A 減小，因此：合適的狹縫寬度是 在 吸光度不減小時的最大狹縫寬度。
（三）空白溶液的選擇
空白溶液是用來調(diào)節(jié)工作零點 即 A=0，T%=100% 的溶液，以消除溶液中其它基體組分以及吸收池和溶劑對入射光的反射和吸收所帶來的誤差。
根據(jù)情況不同，常用空白溶液有如下選擇：
1. 溶劑空白：當(dāng)溶液中只有待測組分在測定波長下有吸收，而其它組分無吸收時
— 用純?nèi)軇┳骺瞻祝?/span>
2. 試劑空白：如果顯色劑或其它試劑有吸收，而待測試樣溶液無吸收
— 則用不加待測組分的其它試劑作空白；
3. 試樣空白：如果試樣基體有吸收，而顯色劑或其它試劑無吸收
— 則用不加顯色劑的試樣溶液作空白；
4. 平行操作空白：用溶劑代替試樣溶液，以與試樣完全相同的分析步驟進行平行操作，用所得的溶液作空白。
