免费人成在线观看网站,狠狠久久精品中文字幕,麻豆激情在线观看,久久精品亚洲日本

  • <li id="uqawe"><delect id="uqawe"></delect></li>
    <ul id="uqawe"></ul> <center id="uqawe"></center>
  • <dfn id="uqawe"><dd id="uqawe"></dd></dfn>
    <center id="uqawe"><code id="uqawe"></code></center><rt id="uqawe"><small id="uqawe"></small></rt>
    食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號

    染色技術(shù)

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-09-01
    核心提示:  由于微生物細胞含有大量水分(一般在80-90%以上),對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,與周圍背景沒有明顯的明暗差。所

      由于微生物細胞含有大量水分(一般在80-90%以上),對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以,除了觀察活體微生物細胞的運動性和直接計算菌數(shù)外,絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后,才能在顯微鏡下進行觀察。但是,任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標本是死的,在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化,不能完全代表其生活細胞的真實情況,染色觀察時必須注意。

      本節(jié)包括四部分:
    一、染色的基本原理
    二、染料的種類和選擇
    三、制片和染色的基本程序
    四、染色方法

    一、染色的基本原理

      微生物染色的基本原理,是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質(zhì)對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附,且吸附作用穩(wěn)固;同樣,堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力,易于吸附。但是,要使酸性物質(zhì)染上酸性材料,必須把它們的物理形式加以改變(如改變pH值),才利于吸附作用的發(fā)生。相反,堿性物質(zhì)(如細胞質(zhì))通常僅能染上酸性染料,若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式,也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

      細菌的等電點較低,pH值大約在2—5之間,故在中性、堿性或弱酸性溶液中,菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷;而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此,帶陰電的細菌常和帶陽電的堿性染料進行結(jié)合。所以,在細菌學(xué)上常用堿性染料進行染色。

      影響染色的其它因素,還有菌體細胞的構(gòu)造和其外膜的通透性,如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結(jié)構(gòu)完整與否,在染色上都起一定作用。此外,培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等,也都能影響細菌的染色。

    二、染料的種類和選擇

      染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等,它們多從植物體中提取得到,其成分復(fù)雜,有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料,也稱煤焦油染料,多從煤焦油中提取獲得,是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類,難溶于水,而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水,通常制成鹽類。

      染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì),分為酸性染料、堿性染料、中性(復(fù)合)染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?/p>

    1、酸性染料

      這類染料電離后染料離子帶負電,如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等,可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時,細菌所帶的正電荷增加,這時選擇酸性染料,易被染色。

    2、堿性染料

      這類染料電離后染料離子帶正電,可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等,在一般的情況下,細菌易被堿性染料染色。

    3、中性(復(fù)合)染料

      酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性(復(fù)合)染料,如瑞脫氏(Wright)染料和基姆薩氏(Gimsa)染料等,后者常用于細胞核的染色。

    4、單純?nèi)玖?/p>

      這類染料的化學(xué)親和力低,不能和被染的物質(zhì)生成鹽,其染色能力視其是否溶于被染物而定,因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物,不溶于水,但溶于脂肪溶劑中,如紫丹類(Sudanb)的染料! 

    三、制片和染色的基本程序

      微生物的染色方法很多,各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同,但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。

    1、制片

      在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水,用接種環(huán)進行無菌操作,挑取培養(yǎng)物少許,置載玻片的水滴中,與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層,為避免因菌數(shù)過多聚成集團,不利觀察個體形態(tài),可在載玻片之一側(cè)再加一滴水,從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋,涂布成薄層,若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液,則直接涂布于載玻片上即可。

    2、自然干燥

      涂片最好在室溫下使其自然干燥,有時為了使之干得更快些,可將標本面向上,手持載玻片一端的兩側(cè),小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發(fā),但切勿緊靠火焰或加熱時間過長,以防標本烤枯而變形。

    3、固定

      標本干燥后即進行固定,固定的目的有三個:

      1)殺死微生物,固定細胞結(jié)構(gòu)。

      2)保證菌體能更牢的粘附在載玻片上,防止標本被水沖洗掉。

     。常└淖?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感裕驗樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。

      固定常常利用高溫,手執(zhí)載玻片的一端(涂有標本的遠端),標本向上,在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次,共約2—3秒鐘,并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚,不覺過燙為宜(不超過60℃),放置待冷后,進行染色。

      以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍,但是應(yīng)當指出,在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用,應(yīng)采用化學(xué)固定法;瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有:酒精(95%),酒精和醚各半的混合物,丙酮,1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結(jié)構(gòu),故較常用。應(yīng)用餓酸固定細胞的技術(shù)如下:在培養(yǎng)皿中放一玻璃,在玻璃上放置玻璃毛細管,在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液,同時在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片,然后把培養(yǎng)皿蓋上,經(jīng)過1—2分鐘后把標本從培養(yǎng)皿中取出,并使之干燥。

    4、染色

      標本固定后,滴加染色液。染色的時間各不相同,視標本與染料的性質(zhì)而定,有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘,而所有的染色時間內(nèi),整個涂片(或有標本的部分)應(yīng)該浸在染料之中。

      若作復(fù)合染色,在媒染處理時,媒染劑與染料形成不溶性化合物,可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染,但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。

    5、脫色

      用醇類或酸類處理染色的細胞,使之脫色?蓹z查染料與細胞結(jié)合的穩(wěn)定程度,鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。

    6、復(fù)染

      脫色后再用一種染色劑進行染色,與不被脫色部位形成鮮明的對照,便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅,石碳酸復(fù)紅最后進行染色,就是復(fù)染。

    7、水洗

      染色到一定的時候,用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉,被菌體吸附的染料則保留。

    8、干燥

      著色標本洗凈后,將標本晾干,或用吸水紙把多余的水吸去,然后晾干或微熱烘干,用吸水紙時,切勿使載玻片翻轉(zhuǎn),以免將菌體擦掉。

    9、鏡檢

      干燥后的標本可用顯微鏡觀察。

      綜上所述,染色的基本程序如下:

      制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。

    四、染色方法

      微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色,但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料,有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法,此外還有鑒別細胞各部分結(jié)構(gòu)的(如芽胞、鞭毛、細胞核等)特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。

    1、單染色法

      用一種染色劑對涂片進行染色,簡便易行,適于進行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下,細菌菌體多帶負電荷,易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此,常用堿性染料進行單染色,如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料,多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時,必須降低染液的PH值,使其呈現(xiàn)強酸性(低于細菌菌體等電點),讓菌體帶正電荷,才易于被酸性染料染色。

      單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。

      染色結(jié)果依染料不同而不同:

      石碳酸復(fù)紅染色液:著色快,時間短,菌體呈紅色! 

      美蘭染色液:著色慢,時間長,效果清晰,菌體呈蘭色。

      草酸銨結(jié)晶染色液:染色迅速,著色深,菌體呈紫色。

    2、革蘭氏染色法

      革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

      細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色,而經(jīng)碘液媒染后,用酒精脫色,在一定條件下有的細菌此色不被脫去,有的可被脫去,因此可把細菌分為兩大類,前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G—)。為觀察方便,脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色,陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌,以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng);弧菌,螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負反應(yīng)。

      革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別,染色反應(yīng)不一樣,F(xiàn)在一般認為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物,它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢,不易脫色,陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底,吸附染料差,易脫色,這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。

      另外,陽性菌菌體等電點較陰性菌為低,在相同PH條件下進行染色,陽性菌吸附堿性染料很多,因此不易脫去,陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如,在強堿的條件下進行染色,兩類菌吸附堿性染料都多,都可呈正反應(yīng);PH很低時,則可都呈負反應(yīng)。此外,兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致,陽性菌透性小,故不易被脫色,陰性菌透性大,易脫色。所以脫色時間,脫色方法也應(yīng)嚴格控制。

      革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟,具體操作方法是:

     。保┩科潭。

     。玻┎菟徜@結(jié)晶紫染1分鐘。

      3)自來水沖洗。

     。矗┘拥庖焊采w涂面染1分鐘。

     。担┧,用吸水紙吸去水分。

     。叮┘95%酒精數(shù)滴,并輕輕搖動進行脫色,30秒后水洗,吸去水分。

     。罚┺t梁色液(。┤10秒鐘后,自來水沖洗。干燥,鏡檢。

      染色的結(jié)果,革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色,負反應(yīng)菌體都呈紅色。

    編輯:foodadmin

     
    分享:
    關(guān)鍵詞: 染色技術(shù)
     

     
     
    推薦圖文
    推薦檢驗技術(shù)
    點擊排行
    檢驗技術(shù)
     
     
    Processed in 1.339 second(s), 278 queries, Memory 2.06 M