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    細(xì)菌染色技術(shù)

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-06-28  來源:生物無憂
    核心提示:一、細(xì)菌的革蘭染色法革蘭染色法(Gram stain)是細(xì)菌學(xué)上最經(jīng)典的、使用最廣泛的一種染色方法.由丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭(Christian Gram
     一、細(xì)菌的革蘭染色法
    革蘭染色法(Gram stain)是細(xì)菌學(xué)上最經(jīng)典的、使用最廣泛的一種染色方法.由丹麥細(xì)菌學(xué)家革蘭(Christian Gram)于1883年創(chuàng)立.細(xì)菌染色后,不僅可以觀察其形態(tài),而且可根據(jù)染色結(jié)果將細(xì)菌分為兩大類,即革蘭陽性菌(G+菌)和革蘭陰性菌(G-菌).
    1、原理:
    (1)G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密(肽聚糖層厚),且脂質(zhì)含量少,乙醇不易滲入脫色;G-菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松(肽聚糖層薄),且脂質(zhì)含量多,乙醇溶解脂質(zhì)后易滲入細(xì)胞而脫色.
    (2)G+菌菌體含有大量核糖核酸鎂鹽,可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合,使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色.G-菌菌體內(nèi)核糖核酸鎂鹽含量小,易被乙醇脫色.
    (3)G+菌等電點(diǎn)比G-菌低,在同一pH條件下陽性菌比陰性菌所帶陰電荷要多,故與帶正電荷的堿性染料(結(jié)晶紫)結(jié)合牢固,不易被乙醇脫色.
    2、應(yīng)用
    革蘭染色法的實(shí)際應(yīng)用意義有三:
    (1)按照革蘭染色法可把細(xì)菌分為G+和G-兩大類;
    (2)G+菌和G-菌的致病性不同,所致疾病各異;
    (3)對G+和G-菌,選擇不同抗菌物治療.
    3、材料 
    (1)葡萄球菌和大腸埃希菌培養(yǎng)18~24h后的混合菌液.
    (2)蘭染色液:結(jié)晶紫染液、碘液、95%酒精、稀釋復(fù)紅或沙黃染液.
    (3)載玻片、接種環(huán)、酒精燈、吸水紙、顯微鏡等.
    4、方法
    標(biāo)本片制備
    (1)載玻片準(zhǔn)備:取一張清潔載玻片,用蠟筆在其背面畫出二個(gè)有一定間隔、直徑約1~2cm的涂抹范圍,用數(shù)字或符號做好標(biāo)記.
    (2)涂片:將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌,冷卻后取菌液直接涂布在標(biāo)記的涂抹范圍內(nèi).接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌.
    (3)干燥:涂片最好在室溫下自然干燥,或?qū)?biāo)本面向上,置于離酒精燈火焰約半尺高處緩慢烘干,切不可放在火焰上燒干.
    (4)固定:將干燥后的涂片用片夾夾住,使涂抹面向上緩慢通過火焰3次,然后自然冷卻.固定即可殺死細(xì)菌,并使細(xì)菌固著于玻片上,以免染色時(shí)脫落;又可使細(xì)菌蛋白凝固,而易著色.
    革蘭染色法:
    (1)初染:在固定好并冷卻了的涂片上滴加結(jié)晶紫染液1~2滴,作用1min后,用細(xì)水流從玻片的一端把游離的染液洗去.
    (2)媒染:滴加盧戈(Lugol)碘液數(shù)滴,作用1min后水洗.碘液是媒染劑,使結(jié)晶紫染液與細(xì)菌結(jié)合更牢固.
    (3)脫色:滴加95%酒精數(shù)滴,輕輕晃動(dòng)玻片,使玻片上流下的酒精液無紫色為止(約需0.5~1min),流水沖洗.
    (4)復(fù)染:滴加稀釋復(fù)紅(或沙黃)染液數(shù)滴,作用1min后流水沖洗.最后用吸水紙印干標(biāo)本片或自然干燥后,玻片上滴加香柏油,用油鏡觀察.
    5、結(jié)果
    G+菌染成紫色;G-菌染成紅色.
    6、影響因素
    ⑴操作因素:涂片太厚或太薄,菌體分散不均勻,可影響染色結(jié)果.固定時(shí)避免菌體過份受熱.脫色時(shí)間要根據(jù)涂片厚薄靈活掌握.
    ⑵細(xì)菌因素:不同時(shí)間培養(yǎng)物,革蘭染色結(jié)果有差異,如葡萄球菌幼齡菌染成紫色.而老齡菌被染成紅色.細(xì)菌染色時(shí)最好用18~24h的細(xì)菌培養(yǎng)物.
    ⑶染液因素:所有染色液應(yīng)防止水分蒸發(fā)而影響濃度,特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用.脫色酒精以95%濃度為宜,若瓶密封不良或涂片上積水過多,可使酒精濃度下降而減弱其脫色能力.
    二、細(xì)菌莢膜染色法(Hiss法)
    1、原理與應(yīng)用 
    細(xì)菌莢膜是細(xì)菌細(xì)胞壁外面的一層粘液性物質(zhì).其對染料的親和力弱,不易著色,通常采用負(fù)染色法染色,即使菌體和背景著色而莢膜不著色.因此在菌體周圍呈一透明圈.由于莢膜含水量在90%以上,染色時(shí)一般不用熱固定,以防莢膜皺縮變形.莢膜染色法用于有莢膜細(xì)菌
    如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定.
    2、材料
    ⑴莢膜菌液
    ⑵結(jié)晶紫酒精飽和液5ml,加蒸餾水95ml 混合液.
    200g/L⑶硫酸銅水溶液.
    3、方法
    將莢膜菌涂片,在空氣中自然干燥,不需加熱固定.滴加結(jié)晶紫染色液,在火焰上微微加熱,使玻片上染液冒蒸汽為止,不要水洗,再用200g/L 硫酸銅水溶液沖洗染液,切勿用流水沖洗.用吸水紙吸干后油鏡觀察.
    4、結(jié)果
    細(xì)菌菌體呈紫色,莢膜呈淡紫色或無色.
    三、細(xì)菌鞭毛染色法
    1、原理與應(yīng)用
    細(xì)菌鞭毛為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官.其形態(tài)細(xì)長,直徑約10~20nm,需用電子顯微鏡才能觀察到.若用特殊染色使鞭毛增粗并著色,則在普通光學(xué)顯微鏡下也可觀察到.鞭毛染色方法很多,但原理基本類似,即在染色前先經(jīng)媒染劑處理,使鞭毛增粗,然后再進(jìn)行染色.
    2、材料 
    (1)變形桿菌6~8h血瓊脂平板培養(yǎng)物.
    (2)染色液.
    A液:200g/L鉀明礬液(加溫溶解)20ml,50g/L石炭酸液50ml,200g/L鞣酸液(加溫溶解)20ml.
    B液:復(fù)紅酒精飽和液.
    取A液9份和B液1份混合后立即過濾.濾液放置6h后,使用最佳.
    (3)蒸餾水管
    3、方法
    (1)細(xì)菌標(biāo)本制備:取變形桿菌血瓊脂平板培養(yǎng)物,仔細(xì)從菌膜伸展最遠(yuǎn)處挑取菌少許,輕輕放入蒸餾水管中,經(jīng)數(shù)min使其自行分散,再3725℃~30min.
    (2)涂片:取上述菌液一接種環(huán),輕輕滴于載玻片上,使成薄膜.涂抹時(shí)接種環(huán)隨水滴移動(dòng),切勿與玻片相磨,以免鞭毛脫落.
    (3)染色:涂片自然干燥(勿用火焰固定)后,加染色液作用1~2min ,水洗、吸干、鏡檢.
    4、結(jié)果
    鞭毛呈淡紅色,菌體呈紅色.
    四、細(xì)菌芽胞染色法
    1、原理與應(yīng)用
    芽胞具有高度的折光性,外膜致密,滲透性低,故普通染色法不易使其著色,芽胞染色法是根據(jù)芽胞既難以著色,而一旦著色又難以脫色的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的.所有芽胞染色法都基于同一個(gè)原則:采用著色力強(qiáng)的染料,并加熱以促進(jìn)標(biāo)本著色,然后使菌體脫色,而芽胞上的染料仍保留,經(jīng)復(fù)染后,菌體和芽胞呈現(xiàn)不同的顏色.
    2、材料
    (1)破傷風(fēng)梭菌48~72h培養(yǎng)物
    (2)石炭酸復(fù)紅液、堿性美蘭液、95%酒精
    3、方法
    (1)將破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)物涂片,自然干燥,火焰固定,滴加石炭酸復(fù)紅液,并加溫至產(chǎn)生蒸汽(不可煮沸)約5min,防止染液干涸,隨時(shí)補(bǔ)充,待載玻片冷卻后,水洗.
    (2)用95%酒精脫色2min,水洗.
    (3)滴加美蘭染液復(fù)染30sec,水洗,待干,鏡檢.
    4、結(jié)果
    芽胞呈紅色,菌體呈藍(lán)色.
    五、抗酸染色法
    1、原理與應(yīng)用
    結(jié)核分枝桿菌對苯胺染料一般不易著色,若加溫或延長染色時(shí)間使其著色后,再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色,經(jīng)此染色后,結(jié)核分枝桿菌及其他分枝桿菌呈紅色,而非抗酸菌和細(xì)胞雜質(zhì)等呈藍(lán)色.
    2、材料
    (1)結(jié)核病人痰
    (2)抗酸染色液
    (3)玻片、片夾、濾紙片、竹簽、空平皿、污物盆.
    3、方法
    (1)取潔凈的竹簽沾取痰中血絲或膿性痰,在清潔無油脂玻片上涂開.涂抹區(qū)約拇指蓋大.用過的竹簽放到空平皿內(nèi)待高壓滅菌.
    (2)涂片自然干燥后,用片夾挾住玻片一端,通過火焰固定.
    (3)涂抹面用濾紙片蓋上,然后往濾紙片上滴加石炭酸復(fù)紅染液,使濾紙片完全被染液浸濕,持玻片在小火上加溫片刻然后離開火焰,此時(shí)可見到玻片上冒出蒸氣.待蒸氣消失后再加溫,如此反復(fù)3~4次,約5min,加溫時(shí)隨時(shí)添加染液勿使紙片干涸.
    (4)玻片冷卻后,用接種環(huán)挑去濾紙扔到污物盆內(nèi),流水沖洗玻片.
    (5)滴加3%鹽酸酒精脫色,至涂抹均勻部位基本沒有紅色再脫下為止,水洗.
    (6)滴加呂氏美藍(lán)染液30sec,水洗.
    (7)吸干、鏡檢.
    4、溶液配制
    萋-尼(Zichl-Neelsen)抗酸染色液
    (1)石炭酸復(fù)紅液:鹼性復(fù)紅4g,溶于95%酒精100ml,作成飽和溶液,再取該飽和液10ml與5%石炭酸溶液90ml混勻即成.
    (2)3%鹽酸酒精液.
    濃鹽酸3ml加入95%酒精97ml中即成.
    (3)呂(Loeffer)氏美藍(lán)染色液
    美藍(lán)2g,溶于95%酒精100ml中,作成飽和液.再取該飽和液30ml與0.01%氫氧化鉀水溶液100ml混合均勻即可.
    六、奈瑟染色法
    1、材料
    (1)染液甲
    第一液:美蘭1g,95%酒精30ml,冰醋酸50ml,蒸餾水100ml.
    第二液:結(jié)晶紫1g, 95%酒精10ml, 蒸餾水300ml.
    以上第一液二份,與第二液一份混合之.
    (2)染液乙,黃叱精1或2g,熱蒸餾水300ml,待溶解后過濾.
    2、染色法
    (1)涂片按常規(guī)法固定后,滴加奈瑟染液甲液數(shù)滴于涂片上,15~30 Sec,水洗.
    (2)用奈瑟染液乙液復(fù)染10~30秒鐘.
    (3)迅速用水洗,吸干、鏡檢.
    3、結(jié)果
    菌體呈鮮明黃色、異染顆粒呈深紫蘭色.
     
    編輯:songjiajie2010

     
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