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    微生物菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)及污染的檢測(cè)與判別

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2020-08-14  來(lái)源:食品微生物檢驗(yàn)公眾號(hào)
    核心提示:現(xiàn)代工業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模越來(lái)越大,每只發(fā)酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米。因此要在短時(shí)間內(nèi)完成發(fā)酵,必須要有數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞
     現(xiàn)代工業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模越來(lái)越大,每只發(fā)酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米。因此要在短時(shí)間內(nèi)完成發(fā)酵,必須要有數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要獲得數(shù)量足夠的健壯的微生物。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后,再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱(chēng)為種子。

     

    微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來(lái),產(chǎn)率有了很大的提高,然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們?cè)谂c雜菌污染的斗爭(zhēng)中,積累總結(jié)出很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。規(guī)范了管理措施,設(shè)計(jì)了一系列設(shè)備(例如密閉式發(fā)酵罐,培養(yǎng)基滅菌設(shè)備,無(wú)菌空氣制備設(shè)備等)和管道,應(yīng)用了無(wú)菌室甚至無(wú)菌車(chē)間,建立了無(wú)菌操作技術(shù),因而大大降低了發(fā)酵染菌率。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅,染菌后輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量,重者造成“倒罐” ,不但浪費(fèi)大量原材料,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,還會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱(chēng)為雜菌污染,及早發(fā)現(xiàn)雜菌并采取相應(yīng)措施,對(duì)減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要。

     

    因此檢查的方法要求準(zhǔn)確、快速。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個(gè)時(shí)期。種子培養(yǎng)期染菌的危害最大,因嚴(yán)格防止。一旦發(fā)現(xiàn)種子染菌,均應(yīng)滅菌后棄去,并對(duì)種子罐及其管道進(jìn)行徹底滅菌。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富,容易染菌,此時(shí)養(yǎng)分消耗不多,應(yīng)將發(fā)酵液補(bǔ)足必要養(yǎng)分后迅速滅菌,并重新接種發(fā)酵。發(fā)酵中期染菌不但嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌株的代謝,而且會(huì)影響產(chǎn)物的生成,甚至使已形成的產(chǎn)物分解。

     

    由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗,代謝產(chǎn)物的生成又不是很多,挽救處理比較困難,可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發(fā)酵后期染菌,此時(shí)產(chǎn)物積累已較多,糖等養(yǎng)分已接近耗盡,若染菌不嚴(yán)重,可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵;若污染嚴(yán)重,可提錢(qián)放罐。染菌程度越重,危害越大;染菌少,對(duì)發(fā)酵的影響就小。所以,實(shí)際生產(chǎn)中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)污染程度和發(fā)酵時(shí)期區(qū)別對(duì)待。

     

    一、實(shí)驗(yàn)器材與試劑

     

    1.器材

    高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、帶搖床的培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)皿、 接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片

     

    2.試劑 

    營(yíng)養(yǎng)瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液

     

    3.培養(yǎng)基

    (1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:直接稱(chēng)量營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉4.5g,溶于100mL蒸餾水配制,pH 7.2,分裝到試管中,滅菌后擺成斜面。

    (2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.5%、磷酸二氫氨0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.1%

    (3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%、蛋白胨0.8%、葡萄糖 0.5%、氯化鈉0.5%、0.4% 酚紅溶液,pH 7.2

     

    二、實(shí)驗(yàn)方法

     

    1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

     

    ①斜面培養(yǎng)基的配制

    配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,分裝,滅菌(121℃條件下滅菌 30min),倒斜面。

     

    ②菌種的活化

    ⑴將大腸桿菌采用無(wú)菌操作的方法接種于斜面上,37℃下培養(yǎng)18h;

    ⑵培養(yǎng)18h后,觀察菌落顏色是否一致,若均為黃色,挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè);若顏色有黃有白,則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。檢測(cè)方法常用染色鏡檢,若檢測(cè)后,沒(méi)有污染,便可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);若檢測(cè)到雜菌,要重復(fù)上述步驟,直到無(wú)菌為止,否則,不能繼續(xù)下一步操作。

     

    ③擴(kuò)大培養(yǎng)

    在無(wú)菌條件下,從檢測(cè)后的活化培養(yǎng)基上挑取10個(gè)左右菌落,用接種針接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中,于37℃下振蕩培16-18h,觀察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察,根據(jù)結(jié)果來(lái)判斷能否進(jìn)行下一步。

     

    2.污染的檢測(cè)和判別

    ①顯微鏡檢查

    ⑴取樣:用無(wú)菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上;

    ⑵制片、染色:自然風(fēng)干后,用番紅染液染色1-2min,水洗;

    ⑶干燥后用油鏡下觀察。

     

    ②平板檢查

    ⑴配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,滅菌,倒平板;

    ⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約10–6-10–7) 后涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,在37℃下培養(yǎng)24h;

    ⑶觀察菌落形態(tài)。

     

    ③肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否徹底)

    將1ml待測(cè)液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中,于37℃下培養(yǎng)24h,觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色。

     

    三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

     

    1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

    觀察到在活化培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大量菌落,且菌落顏色單一,均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量,制作裝片,染色后在顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)多個(gè)視野中都為桿菌,可初步得出活化的菌種中沒(méi)有污染雜菌。挑取沒(méi)有污染雜菌的菌落,用無(wú)菌操作技術(shù)接種,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在適宜條件下培養(yǎng)18h后,得到了大腸桿菌的種子液,吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。

     

    2.顯微鏡檢查

    鏡檢時(shí),多個(gè)視野中均觀察到的均為桿菌,呈鏈狀或單個(gè)存在,沒(méi)有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細(xì)菌,因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染。

     

    3.平板檢查

    從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起,這是典型的大腸桿菌菌落,沒(méi)有觀察到其它形態(tài)的菌落,因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染。

     

    4.肉湯檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否徹底

    葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液,酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色,堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測(cè)液若有菌體存在,則菌體代謝會(huì)使培養(yǎng)基呈酸性,顯示黃色。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后,仍呈現(xiàn)紅色,沒(méi)有變?yōu)辄S色,且澄清,未渾濁,說(shuō)明待測(cè)液中沒(méi)有菌體存在,,因此,所測(cè)的滅菌種子培養(yǎng)基中沒(méi)有被菌體污染。

     

    四、實(shí)驗(yàn)討論

     

    1.在種子的擴(kuò)大培養(yǎng)前要對(duì)菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子,若菌種已活化則可省略這一步。種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí),如果低溫保藏的菌種污染了雜菌,則應(yīng)棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來(lái)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)。

     

    2.采用顯微鏡檢查法,如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標(biāo)菌株不同形態(tài)的菌體則可認(rèn)為是污染了雜菌,該法簡(jiǎn)便、快速,能及時(shí)檢查出雜菌。但是也有其不足之處:①對(duì)含雜菌少的樣品不易得出正確的結(jié)論,故應(yīng)多檢查幾個(gè)視野;②由于菌體較小,本身又處于非同步狀態(tài),應(yīng)注意不同生理狀態(tài)下目標(biāo)菌與雜菌的區(qū)別,必要時(shí)可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對(duì)固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。

     

    3.采用平板檢查法,若出現(xiàn)與目標(biāo)菌株形態(tài)不一的菌落,就表明可能被雜菌污染;若要進(jìn)一步確證,可配合顯微鏡形態(tài)觀察,若個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標(biāo)菌相異,則可確認(rèn)污染了雜菌。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測(cè),形象直觀,肉眼可辨,不需儀器。但需嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作技術(shù),所需時(shí)間較長(zhǎng),而且無(wú)法區(qū)分形態(tài)與目標(biāo)菌相似的雜菌。在污染初期,目標(biāo)菌占絕大部分,污染菌數(shù)量很少,所以要做比較多的平行試驗(yàn)才能檢出污染菌。

     

    4.肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)基的滅菌是否徹底,不適用于發(fā)酵液的檢查。

     

    5.可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來(lái)檢測(cè)是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過(guò)程中,以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo),以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標(biāo),作曲線,若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化,則很可能是污染了雜菌。但是,發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌。

     

    五、結(jié)論

     

    了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害,知道染菌不僅浪費(fèi)大量原材料,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且污染了環(huán)境,所以,在種子活化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中每一步均需進(jìn)行無(wú)雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來(lái)檢測(cè)雜菌污染,方法較為簡(jiǎn)便、形象直觀,但是,若要進(jìn)行更準(zhǔn)確的檢測(cè),最好再做較多的平行實(shí)驗(yàn)。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否徹底的有效方法。

    編輯:songjiajie2010

     
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