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    氯霉素ELISA試劑盒說明書

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2009-03-04
    核心提示:1 簡介 本產(chǎn)品是用競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理來檢測生物樣本中的氯霉素含量。本試劑盒包含檢測所需的所有試劑包括標(biāo)準(zhǔn)品。 檢測數(shù)量: 96孔(包括標(biāo)準(zhǔn)品) 檢測時間: 20分鐘 2 應(yīng)用范圍 本試劑盒可用于檢測奶、組織(肌肉、肝臟、腎臟、蝦類、蟹類、魚類)、尿液、血液和飼
    1 簡介
    本產(chǎn)品是用競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理來檢測生物樣本中的氯霉素含量。本試劑盒包含檢測所需的所有試劑——包括標(biāo)準(zhǔn)品。
    檢測數(shù)量:96孔(包括標(biāo)準(zhǔn)品)
    檢測時間:20分鐘
     
    2 應(yīng)用范圍
    本試劑盒可用于檢測奶、組織(肌肉、肝臟、腎臟、蝦類、蟹類、魚類)、尿液、血液和飼料樣本中的氯霉素。
     
    3 原理
    反應(yīng)在包被了氯霉素抗體的固相微孔板上進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和酶標(biāo)物加入到微孔中,第一次溫浴時,標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的游離氯霉素分子與酶標(biāo)記的氯霉素分子競爭結(jié)合吸附在固相上的抗體結(jié)合位點。沒有結(jié)合的分子被清洗除去,通過加入顯色底物來確定已經(jīng)結(jié)合的酶的活性,酶使得無色的底物轉(zhuǎn)變成蘭色,加入反應(yīng)終止液使得蘭色變?yōu)辄S色,用酶標(biāo)儀在450nm處讀出吸光度。顏色的深淺可以轉(zhuǎn)換為樣品中氯霉素的不同濃度。
     
    4 試劑組成
    微孔板:96孔(12×8,可分拆)直接包被氯霉素抗體
    標(biāo)準(zhǔn)品:0.025ng/mL; 0.1ng/mL; 0.25ng/mL; 1ng/mL; 4ng/mL; 1ml含0.1ug/ml濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品1瓶
    酶標(biāo)物凍干粉:玻璃瓶 1瓶
    酶標(biāo)物稀釋液:13ml塑料瓶1瓶(棕色)
    顯色劑:13ml 塑料瓶1瓶(棕色)
    終止液:13ml塑料瓶1瓶(白色)
    清洗液10×50ml塑料瓶1瓶(白色)
    氯霉素樣品稀釋液10×50ml塑料瓶1瓶(白色)
     
    5 需要但未提供的材料
    樣品前處理需要:
     - 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷、三氯甲烷
     - 組織勻漿機、天平、水浴鍋,搖床(振蕩器)
     - 離心機,氮吹儀,混合振蕩器
    檢測中需要:
    - 20~200ul移液槍和槍頭
    50~200ul多通道移液槍和槍頭
    - 配備450nm濾光片的酶標(biāo)儀
    - 擠瓶
     
    6 注意事項
    - 終止液含有硫酸,注意不要接觸皮膚
    - 顯色劑有毒,不要接觸皮膚;如果接觸請用水沖洗
    - 不要在有效期過后使用試劑
    - 不同批號的試劑不要混用
     
    7 保存
    2~8℃保存,切勿冰凍
    - 沒有使用的微孔條請務(wù)必用干燥劑保存在密封的袋子中
     
    8 樣品前處理
    8.1尿樣
    8.1.1直接法
    200µl尿樣與800µl氯霉素樣品稀釋液混合
    — 混合物在2000g,離心10min
         50µl上清用于檢測
         檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)5
    8.1.2抽提法
    建議對“深色/不潔”尿樣采用
    1ml尿液用1M乙酸調(diào)PH值到4.8
    — 加入25µl蝸牛液(Helix pomatia juice),37℃下溫浴過夜或55℃下溫浴2小時。
    — 冷卻至室溫,并將PH值調(diào)節(jié)到7±0.5
    — 加入2ml乙酸乙酯,混合1min。靜置5-10 min分層。
    — 將1ml上層液(乙酸乙酯層)轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。
    50℃,氮吹儀吹干
    — 用200氯霉素樣品稀釋液溶解,混勻
    — 取50µl用于檢測
         檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.4
    8.2 血清/血漿樣品
    1ml血清/血漿加入2ml乙酸乙酯混合1min,靜置5-10min,令其發(fā)生相分離
         1ml乙酸乙酯于一新的試管
         50℃,氮吹儀吹干
    — 加入500µl氯霉素樣品稀釋液混合均勻
         50µl用于檢測
         檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1
    8.3 奶
    8.3.1
    2000g,離心15min,去除上層脂肪
    — 取50ul用于檢測。
    注意:檢測酸奶時,應(yīng)調(diào)樣品PH值至中性。
    8.3.2
    — 取5ml牛奶樣品于一試管中
    2000g,離心15min,去除上層脂肪
         2.5ml脫脂奶于一新的試管
         加入5ml乙酸乙酯,渦旋混合1min,靜置10min
         4ml乙酸乙酯上層到干凈玻璃管中
         50℃,氮吹儀吹干
    — 用200µl氯霉素樣品稀釋液溶解
    — 取50µl用于檢測
    — 計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.1
    (脫脂奶粉處理方法:將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉,再按上述步驟操作)
    8.4蛋類樣品
         1g勻漿全蛋
         加入6ml乙酸乙酯渦旋混合1min
    2000g離心10min
         3ml上層乙酸乙酯于一新的試管
         50℃,氮吹儀吹干
    — 加入1ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V),再加入500µl氯霉素樣品稀釋液,渦旋混合1min
    2000g,離心10min
         50µl上層用于檢測
         計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1
    注意:若上層乳化,可將試管置于80℃水浴約5min,并再次進(jìn)行離心。
    8.5 組織樣品(肉類、肝臟、蝦類、蟹類、魚類)
    方法一:
    — 取3g勻漿樣品
    — 加入6ml乙酸乙酯渦旋混合,振搖10min
    2000g,離心10min
         4ml乙酸乙酯上層于一新的試管
         50℃,氮吹儀吹干
    — 加入1ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V),再加入1ml氯霉素樣品稀釋液,渦旋混合1min
    2000g,離心10min
         吸取50µl上層用于檢測。
         計算最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.5
    注意:若上層乳化,可將試管置于水浴(80℃ )約5min,并再次進(jìn)行離心。
    另:可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷,離心后應(yīng)完全去除上層正己烷,移取50µl下層用于檢測。
    方法二:用于蝦、魚、蟹類的大樣品量處理
    10g勻漿化樣品與20ml乙酸乙酯混合10min
    2000g,離心10min(或用濾紙過濾)
         10ml乙酸乙酯層于一新的試管
         50℃,氮吹儀吹干
    — 加入2ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V)(或2ml正己烷,參見方法一),并加入1ml氯霉素樣品稀釋液,充分混合。若發(fā)現(xiàn)乳化,可將試管在水。80℃)中加熱(5min)。并將此溶液在2000g下離心10min。
    — 利用巴斯德滴管轉(zhuǎn)移上層清夜(若用正己烷,清夜則在下層)于清潔玻璃管中。
    — 再加入1ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V)(或1ml正己烷)。混合上述溶液并離心分離如上。
    — 吸取50µl上層用于檢測(若用正己烷,清液則在下層)。
    注:檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)0.2
    8.6 蜂產(chǎn)品
    8.6.1蜂蜜樣品
    3g樣品與3ml蒸餾水充分混合
    — 加入6ml乙酸乙酯充分振蕩混合10min
    2000g離心10min
         轉(zhuǎn)移4ml上層乙酸乙酯于一新的試管
         50℃,氮吹儀吹干
    — 殘留物充分溶解于1ml氯霉素樣品稀釋液
    — 吸取50µl用于檢測
    對于不純凈的蜂蜜應(yīng)進(jìn)行脫脂處理:
    — 將氮流蒸發(fā)后的殘留物溶于1ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V),加入1ml樣品稀釋液
    — 渦旋混合1min,2000g,離心10min
    注意:若上層乳化,可將試管置于水。80℃)約5min,并再次進(jìn)行離心。
         吸取50µl上層用于檢測。
         檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)0.5。
    另:可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷,離心后應(yīng)完全去除上層正己烷層,移取50µl下層用于檢測。
    8.6.2蜂王漿
    1g蜂王漿與4ml抽提緩沖液(10.1g 1-庚烷磺酸,11.4g Na3PO4.12H2O。溶于1000ml蒸餾水中,用H3PO4調(diào)整pH2.0)混合30min
    3000g離心10min
    — 取2.5ml上清液用Oasis HLB柱(60mg Waters公司W(wǎng)AT094226)按以下固相抽提步驟純化:
    — 依次用1ml100%甲醇和1ml蒸餾水活化該柱(樣品過柱前柱不能過干,否則需要重復(fù)活化)
    — 將上述2.5ml上清液真空抽濾過柱
    — 用3ml蒸餾水及3ml 50%(1:1;V:V)甲醇洗柱,真空干柱
    — 用1ml100%甲醇洗脫,用干凈玻璃管收集洗脫液
    — 洗脫液在溫和氮流下蒸發(fā)甲醇
    — 樣品殘留物溶入0.5ml氯霉素樣品稀釋液中
         吸取50µl用于檢測
         檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)1
    注意:若無真空泵,可使用正壓洗滌柱子;
          流速均設(shè)定為1ml/min。
    8.7 飼料樣品
    5g樣品與20ml蒸餾水混勻
    — 取5ml混合物到干凈玻管中,加入10ml乙酸乙酯混合2min
    2000g離心10min
    — 轉(zhuǎn)移5ml乙酸乙酯(上層)到干凈玻管中,50℃溫和的氮流下蒸發(fā)
    — 殘留物溶于0.5ml異辛烷/三氯甲烷(2:3,V/V),加入0.5ml氯霉素樣品稀釋液,混合液渦旋1min,
         2000g離心10min
         50µl上層用于檢測
         檢測最終結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)1
    注:若發(fā)現(xiàn)乳化,可將試管在水。80℃)中加熱(5min),并將此溶液再次離心,吸取50µl上層清液檢測
    注意:本說明書提供的樣品前處理方法僅作參考,實驗人員可以根據(jù)自己的經(jīng)驗作改善以提高檢測準(zhǔn)確度。
     
    9 工作液準(zhǔn)備
    為了避免污染,建議在配置標(biāo)準(zhǔn)品不要與試劑檢測工作在同一室內(nèi)進(jìn)行,并使用不同的移液槍。
    注意:整套標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該在每個檢測實驗前臨時配置!
    氯霉素樣品稀釋液:用蒸餾水10倍稀釋(1+9),注意:如果出現(xiàn)結(jié)晶,請將溶液放于室溫下?lián)u動,重新完全溶解。
    標(biāo)準(zhǔn)品配制:使用已經(jīng)稀釋的氯霉素樣品稀釋液。
    -         10ng/ml濃度:100ng/ml原始濃度溶液100ul +稀釋液900ul(1:10)
    -         4ng/ml濃度:10ng/ml溶液400ul +稀釋液600ul(1:2.5)
    -         1ng/ml濃度:4ng/ml 溶液 200ul +稀釋液600ul(1:4)
    -         0.25ng/ml濃度:1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul(1:4)
    -         0.1ng/ml濃度:0.25ng/ml溶液400ul+稀釋液600ul(1:2.5)
    -         0.025ng/ml濃度:0.1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul(1:4)
    此氯霉素樣品稀釋液也應(yīng)當(dāng)用于B0孔。
    酶標(biāo)物:實驗前用12mL酶標(biāo)物稀釋液溶解,并充分混勻。靜置8小時(或過夜,但至少4小時),切勿渦旋混勻。
    清洗液:用蒸餾水10倍稀釋(1+9)。注意:如果出現(xiàn)結(jié)晶,請將溶液放于室溫下?lián)u動,重新完全溶解。
    顯色劑:備用。
    終止液:備用。
     
    10 分析步驟
    10.1 注意事項
    - 使用前請將試劑盒恢復(fù)到室溫(20~25℃)
    - 使用后請立即將所有試劑放回2~8℃
    - 請不要改動分析步驟,尤其:
       - 不要在低于20℃條件下溫浴
       - 要使用準(zhǔn)確和精確的移液槍和適合的槍頭
       - 一旦開始實驗,完成所有步驟,不要中斷
       - ELISA結(jié)果的重復(fù)性跟洗板的效果和一致性非常密切,請遵循操作方法
    - 不同的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品使用一次性槍頭以避免交叉污染
    - 不要讓槍頭和微孔中的溶液或內(nèi)避接觸
    10.2 檢測程序
    1. 用記錄表記錄B0,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,要求做雙孔平行。
    2. 加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品:
     -50ul氯霉素樣品稀釋液加入B0孔
     -標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50ul加入微孔
    3. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul酶標(biāo)物溶液。
    4. 晃動酶標(biāo)板。
    5. 室溫(20~25℃)下溫浴10min。溫浴過程中建議晃動酶標(biāo)板2~3次。
    6. 清洗步驟:
     - 倒去微孔中的溶液
     - 用擠瓶將所有微孔加滿清洗液,然后倒去
     - 在吸水紙上拍打除去殘留溶液
     重復(fù)清洗四遍。
     不要讓微孔干燥。
    7. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul反應(yīng)液。
    8. 輕輕晃動酶標(biāo)板。
    9. 室溫(20~25℃)下溫浴10min。
    10. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul的終止液。
    11. 輕輕晃動酶標(biāo)板。
    12. 在450nm下檢測吸光度,結(jié)果在10min內(nèi)讀取最佳,30min內(nèi)有效。
     
    11 結(jié)果計算
    - 計算最大結(jié)合率(B0)、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度
    - 根據(jù)以下公式來計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的結(jié)合率

    =B/B0 (%)
    ×100
       標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)吸光度

         最大結(jié)合孔吸光度
    - 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0值在半對數(shù)曲線中畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線
    - 獲得樣品的B/B0值后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以得到對應(yīng)的氯霉素濃度值ppb(ug/kg或ug/L),實際濃度還要乘上稀釋倍數(shù)。
     
    12檢測下限
    組織          0.1ng/g
    尿液和奶樣    0.2ng/mL
     
    13 特異性
    分子
    交叉反應(yīng)%
    氯霉素
    100
    琥珀氯霉素
    92
    氯霉素-葡萄糖苷酸
    57
    阿莫西林
    < 0.1

    14標(biāo)準(zhǔn)曲線模型
    模型 

        北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
        北京市朝陽區(qū)朝陽路財滿街財經(jīng)中心9號樓1單元702室 郵編100025
        電話 010-65567512   傳真010-65563420
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