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    呋喃它酮代謝物(AMOZ)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2009-03-04
    核心提示:一、概要 用來(lái)檢測(cè)呋喃它酮代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS,酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用AMOZ衍生物的特異性抗體,具有很高的精確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間,檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來(lái)。 二、試驗(yàn)原理 本試劑
    一、概要
    用來(lái)檢測(cè)呋喃它酮代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS,酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用AMOZ衍生物的特異性抗體,具有很高的精確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間,檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來(lái)。

    二、試驗(yàn)原理
    本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物AMOZ經(jīng)衍生化后和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃它酮代謝物的衍生物抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物AMOZ代謝物的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中呋喃它酮代謝物的殘留量。

    三、適用范圍
       可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織(雞、豬、牛、魚、蝦等)、牛奶和蜂蜜中呋喃它酮代謝物的殘留量。

    四、交叉反應(yīng)率
    呋喃它酮代謝物………………………………………  100%
    呋喃唑酮代謝物…………………………………小于 0.1%
    呋喃妥因代謝物…………………………………小于 0.1%
    硝基糠腙(呋喃西林)代謝物…………………小于0.1%
    呋喃唑酮………………………………………………小于1%
    呋喃它酮………………………………………………11.1%
    呋喃妥因………………………………………………小于1%
    呋喃西林…………………………………………小于1%

    五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
    設(shè)備:
    ┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
    ┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
    ┅┅均質(zhì)器
    ┅┅振蕩器
    ┅┅離心機(jī)
    ┅┅天平:感量0.01g
    ┅┅刻度移液管:10ml
    ┅┅洗耳球
    ┅┅容量瓶:10ml、100ml、1L
    ┅┅玻璃試管:10ml
    ┅┅聚苯乙烯離心管:2ml、10ml、50ml
    ┅┅微量移液器:?jiǎn)蔚?20ml~200ml、100ml~1000ml
    多道 250ml
    試劑:
    ┅┅乙酸乙酯(分析純)
    ┅┅正己烷(或正庚烷)(分析純)
    ┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)
    ┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)(分析純)(供奶樣用)
    ┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)(供奶樣用)
    ┅┅濃鹽酸
    ┅┅氫氧化鈉(分析純)
    ┅┅去離子水

    六、提供的材料與試劑
    1、96孔酶標(biāo)板×1塊 (包被有偶聯(lián)抗原)
    2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(1ml/瓶)
    0ppb,0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb
    3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶) 100ppb
    4、酶標(biāo)二抗         12ml …………………… 紅色帽
    5、抗體工作液       7ml …………………… 綠色帽
    6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
    7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
    8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
    9、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽
    10、2×濃縮復(fù)溶液      50ml……………………… 藍(lán)色帽
    11、2-硝基苯甲醛      15.1mg…………………… 黑色帽

    七、溶液的配制
    配液1:衍生化試劑 
              向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml(濃度為10mM)。
    配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液
                稱取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。
    配液3: C液(供奶樣用):
    0.36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)溶液
                 稱取10.7g 二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml
          D液(供奶樣用):
    1M硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)溶液
                 稱取28.8 g七水合硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml。
    配液4: 1M鹽酸溶液      
                 量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。
    配液5: 1M 氫氧化鈉溶液
                 稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
    配液6: 復(fù)溶工作液
    用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋(1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶,復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
    配液7: 洗滌液工作液
    用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌,洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

    八、樣本前處理步驟
    樣本處理前須知
    處理任何樣本時(shí),都必須注意:
    (a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
       (b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    (c)衍生化試劑可于2-8℃保存半年。
    (d)磷酸氫二鉀溶液可于2-8℃保存三個(gè)月。
    (e)鹽酸溶液可于室溫保存三個(gè)月。
    (f)氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個(gè)月。
    (g)未處理的樣本冷凍保存。
    (h)處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時(shí)。
    (一)肌肉、肝臟、水產(chǎn)(魚蝦等)組織前處理方法
    ┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本;
    ┅┅接(四)的描述方法。
    注:樣本應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存
    (二)牛奶前處理方法
    ┅┅取牛奶樣本,3000g以上,10℃離心10min,吸除上層脂肪;
    ┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中;
    ┅┅分別加入250ml C液和250ml D液(見(jiàn)配液3);
    ┅┅用振蕩器充分混合樣本后,3000g以上,4~12 oC(39-54℉)離心10min。如果沒(méi)有恒溫離心機(jī),則先將樣本降溫至大約8 oC(46℉),然后離心;
    ┅┅接(四)的描述方法
    (三)蜂蜜前處理方法
    ┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中;
    ┅┅用4ml去離子水,用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解;
    ┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液(見(jiàn)配液4)和100ml衍生化試劑(見(jiàn)配液1),用振蕩器充分振蕩;
    ┅┅接(四)第二步描述方法(標(biāo) * 處)。
    (四)接上面的方法
    ┅┅稱取1.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本(肝樣/肉樣)、制備好的牛奶樣本上清液1.1ml(相當(dāng)于1ml的奶樣),分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液(見(jiàn)配液4)和100ml衍生化試劑(見(jiàn)配液1),用振蕩器充分振蕩2min;
    *┅┅在37 oC過(guò)夜孵育(大約16h);
    ┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液(見(jiàn)配液2)、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液(見(jiàn)配液5)和5ml乙酸乙酯,用振蕩器劇烈振蕩30s;
    ┅┅3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
    ┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中,于50~60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?br /> ┅┅加入1ml正己烷(或正庚烷),用渦旋儀渦動(dòng)30s,再加入1ml復(fù)溶工作液(見(jiàn)配液6),用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻;
    ┅┅3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
    ┅┅除去上層有機(jī)相,取下層水相50µl用于分析。

    九、檢測(cè)步驟
    測(cè)定前應(yīng)須知:
    1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
    2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
    3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
    4、在所有恒溫孵育過(guò)程中,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
    操作步驟:
    1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
    2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
    3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
    4、編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
    5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對(duì)應(yīng)的微孔中,然后加入抗體工作液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
    6、洗板:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見(jiàn)配液7)250ml/孔,充分洗滌4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。
    7、加酶標(biāo)二抗:加入酶標(biāo)二抗100ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟6。
    8、顯色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min(見(jiàn)注意事項(xiàng)8)。
    9、測(cè)定:加入終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。

    十、結(jié)果判定
        結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃它酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。
    1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.301,樣本2的吸光度值為0.830,標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是: 0ppb為2.018;0.1ppb為1.475;0.3ppb為1.030;0.9ppb為0.472;2.7ppb為0.187; 8.1ppb為0.079。則樣本1的濃度范圍是0.9ppb-2.7ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃它酮代謝物殘留的濃度范圍;樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb,再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃它酮代謝物殘留的濃度范圍。
    2、定量分析
    (1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
    百分吸光度值(%)= B ×100%
     B0 
    B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
    B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
    (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以呋喃它酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃它酮代謝物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。
    樣本稀釋倍數(shù)
    水產(chǎn)(魚蝦等)、肌肉、肝臟樣品稀釋倍數(shù):2
    奶樣樣品稀釋倍數(shù):2
    蜂蜜樣品稀釋倍數(shù):2

    十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
    試劑盒靈敏度:0.1ppb
    樣本最低檢測(cè)限:
    因組織樣品存在一定的干擾,檢測(cè)下限為0.3ppb
    奶樣、蜂蜜………………………………………………0.2ppb
    準(zhǔn)確度:
    水產(chǎn)、雞肉、肝臟組織………………………………  75±15%           蜂蜜 ……………………………………………… 90±15%
    奶樣…………………………………………………  90±10%
    精密度:
    試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

    十二、注意事項(xiàng)
    1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20-25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
    2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
    3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
    4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
    5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
    6、儲(chǔ)存條件
    保存試劑盒于2-8℃,不要冷凍,將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
    7、試劑變質(zhì)的跡象
    發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
    8、在加入底物液A和底物液B液后,一般顯色10-15min即可。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)30min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
    9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

    十三、貯藏條件及保存期
         貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
    保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。

        北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
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