校準(zhǔn)曲線:是指描述待測物質(zhì)濃度或量與相應(yīng)的測量儀器響應(yīng)量或其它指示量之間的定量關(guān)系的曲線。
校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線。
標(biāo)準(zhǔn)曲線:取不同含量標(biāo)準(zhǔn)溶液,直接加入試劑,顯色后進(jìn)行測定,得出濃度值與信號(hào)值的線性關(guān)系。
工作曲線:取不同量標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過與樣品分析相同的前處理步驟(如蒸餾、消解、水浴、萃取、振蕩等),由此得出濃度值與信號(hào)值之間的線性關(guān)系。
注意:如經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí),標(biāo)準(zhǔn)溶液系列在省略部分操作步驟時(shí),直接測量的響應(yīng)值與全部操作步驟具有一致結(jié)果時(shí),可允許省略步驟。
空白試驗(yàn):在制作校準(zhǔn)曲線時(shí)必須同時(shí)作兩個(gè)空白試驗(yàn)。空白試驗(yàn)是除用水代替樣品外,其他所加試劑和操作步驟均與樣品測定完全相同的操作過程。
試驗(yàn)用水、試劑質(zhì)量、器皿、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作過程中的沾污等因素都影響空白試驗(yàn)的測定值(即空白值)。如空白值出現(xiàn)異常,會(huì)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度,應(yīng)從上述幾方面尋找原因。
這些影響因素控制好后,每個(gè)分析項(xiàng)目的空白值均會(huì)在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。一般來說,空白值越小越好。
相關(guān)系數(shù)(r):表示校準(zhǔn)曲線的精密度,分光光度法要求 r ≥0.999,否則應(yīng)查找原因加以糾正,重新制作合格的校準(zhǔn)曲線。
斜率(b):表示校準(zhǔn)曲線的靈敏度。它除了受方法的靈敏度影響外,還與顯色反應(yīng)條件(如環(huán)境溫度、顯色溫度、試驗(yàn)用水、試劑質(zhì)量、顯色溶液的pH值)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確度、測量儀器的靈敏度、波長的準(zhǔn)確度以及分析人員的操作水平等有較大關(guān)系。
上述這些影響因素控制好,大多數(shù)分析項(xiàng)目的斜率能保持在一定的范圍內(nèi),當(dāng)發(fā)現(xiàn)斜率上移或下降,超出了范圍,應(yīng)從各影響因素中查找。
校準(zhǔn)曲線的線性檢驗(yàn),即精密度檢驗(yàn)。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)知識(shí),若2個(gè)變量呈線性關(guān)系,則關(guān)系的密切程度可用簡單線性相關(guān)系數(shù)r來表示。在Excel中的函數(shù)是PEARSON(皮爾生)函數(shù)。r值的范圍在-1~1。r>0為正相關(guān),r<0為負(fù)相關(guān)。r的絕對(duì)值越大,則相關(guān)程度越高;r值越接近于0,相關(guān)越不密切;當(dāng)r=0時(shí),表示2個(gè)變量之間不相關(guān)。
在水質(zhì)檢驗(yàn)中,明確要求|r| ≥0.999;對(duì)于石墨爐原子吸收光譜法,|r| ≥0.995也能接受。
某些分析項(xiàng)目,由于含量很低或操作中的影響因素較多,如原子吸收中的石墨爐分析,某些氣相色譜項(xiàng)目,相關(guān)系數(shù)可適當(dāng)放寬,要求|r| ≥0.995。
如果校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不能滿足規(guī)定的要求,則應(yīng)找出原因并加以糾正,重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。通常情況下,影響校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的因素主要包括:標(biāo)樣系列的配制、測定波長、光源狀態(tài)、進(jìn)樣方式及分析方法本身的精密度、儀器的精密度等。
校準(zhǔn)曲線的截距檢驗(yàn),即準(zhǔn)確度檢驗(yàn)。截距表示試劑空白的大小,它是圍繞總體均值0呈正態(tài)分布的隨機(jī)變量,是實(shí)驗(yàn)室誤差在y軸上的反映。實(shí)驗(yàn)誤差越小,截距越趨近于0。理想的回歸直線,截距a=0。
一般要求a≤0.005,當(dāng)a>0.005時(shí),應(yīng)作截距的顯著性檢驗(yàn)。但由于存在難以控制的隨機(jī)因素,實(shí)驗(yàn)中存在正的或負(fù)的系統(tǒng)誤差,多數(shù)回歸直線的截距不為0。遇到這種情況時(shí),需要按統(tǒng)計(jì)程序?qū)⑺媒鼐郺與0作t檢驗(yàn),即顯著性檢驗(yàn)。
經(jīng)檢驗(yàn),在給定置信水平下(通常取95%)無顯著性差異時(shí),a方可作0處理;若a與0存在顯著性差異,表示校準(zhǔn)曲線的回歸計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度不高,應(yīng)找出原因予以校正;貧w方程如果不經(jīng)上述檢驗(yàn)和處理就直接投入使用,則必將給測定結(jié)果引入差值等于a的系統(tǒng)誤差。
截距檢驗(yàn)也可以采用截距a對(duì)相對(duì)剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差 SE 的相對(duì)值作為檢驗(yàn)指標(biāo)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值,其容許范圍為≥30%。對(duì)于不同的分析方法和精密度要求,容許范圍可作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
3. 斜率檢驗(yàn)
即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度,方法靈敏度是隨實(shí)驗(yàn)條件的變化而改變的,在完全相同的分析條件下,僅由于操作中的隨機(jī)誤差導(dǎo)致的斜率變化不應(yīng)超出一定的允許范圍,此范圍因分析方法的精度不同而異。
例如:一般來說,分子吸收分光光度法要求其相對(duì)差值小于5%,而原子吸收分光光度法則要求其相對(duì)差值小于10%等。
由于校準(zhǔn)曲線的斜率常隨環(huán)境溫度、試劑批號(hào)和貯存時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件的改變而變動(dòng),因此,在測定試樣的同時(shí)繪制校準(zhǔn)曲線是最為理想的。
但在實(shí)際檢測工作中,當(dāng)一定期限內(nèi)的環(huán)境、氣候、儀器、人員等條件變化不大時(shí),可以使用相同的校準(zhǔn)曲線,而不需要每次都繪制。
此時(shí),需要根據(jù)設(shè)備或方法的穩(wěn)定性定期對(duì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢查,使用的統(tǒng)計(jì)量就是剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差 SE 或相對(duì)偏差。
剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差SE 是通過線性回歸法,計(jì)算縱坐標(biāo)預(yù)測值所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)誤差。在Excel中的函數(shù)是STEYX函數(shù)。校準(zhǔn)曲線用y=a+bx來表示。
根據(jù)正態(tài)分布原理,線性方程在不同置信水平下的置信區(qū)間為式(1)—式(3):
68.3%置信區(qū)間y=a+bx±SE (1)
95.5%置信區(qū)間y=a+bx±2SE (2)
99.7%置信區(qū)間y=a+bx±3SE (3)
當(dāng)檢查校準(zhǔn)曲線時(shí),需要測定空白平行樣和曲線中間點(diǎn)濃度平行樣,并分別求取信號(hào)值的平均值,再以中間點(diǎn)濃度的信號(hào)值扣除空白。當(dāng)所獲信號(hào)值沒有落在相應(yīng)置信區(qū)間時(shí),則曲線不能再被使用,需要重新測定標(biāo)樣系列,并重新制作回歸曲線。