從上述要求中可以直觀的看出,不同色譜技術對于分離度的要求不盡相同,至于個中緣由我們暫不揣度。只是有一點很重要:分離度不是指導原則等文件規(guī)定死的一個參數(shù),正如大多技術參數(shù)一樣,始終是為了滿足使用目的而進行的“私人訂制”,量后裁!
一、什么是基線分離?
但是,理論指導實踐,實踐是檢驗真理的唯一標準。比如說,上面對于基線分離的描述情形,在實際工作中基本不可能,而且說“基本”是為了滿足“一切皆有可能”的嚴謹,否則可以直接說“根本不可能”。因為德國哲學家萊布尼茨說,世界上沒有完全相同的兩片樹葉,而每一個色譜工作者都可以說,世上沒有完全相同的兩個色譜峰。
既然如此,那我們就不要再執(zhí)念于分離度1.5了,也不要自欺欺人的出具一個顯示分離度大于1.5的色譜報告而不看實際分離效果了。
二、分離度如何定?
仿制藥或者改良型新藥,甚至創(chuàng)新藥!99.9%的核心技術思想離不開模仿、借鑒,還有0.1%留給那些從0到1的“傳說”。同樣的,我們這個問題,不妨看看別人家的孩子是如何優(yōu)秀解決的。
下表1列舉了從中國藥典以及歐洲藥典中隨機摘錄了一些典型的實例,對于分離要求可以說是“五花八門”。當然,這里對于具體品種為何制定了當前的分離要求,以及做了哪些研究,我們暫不做深究,也確實有心無力,無從下手,僅僅從表象來看個熱鬧。
如果說中國藥典中的例子還算中規(guī)中矩的拓寬了我們對分離度1.5的認識,那歐洲藥典分離度3.3、1.7、1.1是什么操作?這種有零兒有整兒的分離度是怎么搞出來的兒?峰谷比又是什么操作,跟分離度有什么區(qū)別,我該怎么選?看完以后什么感覺?眼花繚亂,再加上點眩暈,有點上頭!
帶著一腦門兒的問號,總感覺,法典里透著點草率,嚴謹中不失那么點隨意。要不是看在歐洲藥典的面子上,領導不得罵的你找不著北?
能!大寫的。
而且,在這個彰顯個性,鼓勵創(chuàng)新的時代里,建議不要做分離度1.1、3.3這種純仿制,也不要假模假式的做一些分離度1.2、3.4這種me-too,可以嘗試做一些分離度2.2、4.4這種me-better,或者大膽一點做一些分離度1.03、2.21這種四不像。
三、如何證明合理性?
實際工作中也接觸到不少人有這個想法:當分離度連中國藥典那除另有規(guī)定外的1.5都達不到時,開始動了定分離度1.0、1.2的心思。但往往只是大筆一揮而已!比如,方法開發(fā)及方法驗證時實際分離度為1.4,為了日后方法系統(tǒng)適用性通過性的保險起見,懷著一絲的忐忑,帶著歐洲藥典的一絲安慰,標準制定時寫下了1.2,大膽一點的直接來個1.0。
當然,不僅是達不到分離度1.5時的退讓,更有很多達到1.5后的前進,比如分離度應大于10.0。這些數(shù)值的制定不僅僅是一個耐用性的探索,更不是冒險或保守之類的估計,而是需要具體的試驗設計去驗證。
根據(jù)以上信息,我們可以推斷的是,實際分離效果肯定不止1.1,這只是一個最低可接受限度。因此在正常色譜條件下對方法進行完整驗證后,針對希望擬定的分離度再次進行試驗設計以驗證合理性。
1、擬定分析方法耐用性的關鍵參數(shù):碳酸銨溶液濃度、流速、柱溫、色譜柱及儀器。
2、擬定關鍵耐用性參數(shù)在日常檢測中可能出現(xiàn)的偏離,比如碳酸銨溶液濃度由于配制過程導致的誤差,由于儀器本身性能導致的流速及柱溫控制差異,色譜柱批次間的差異,不同儀器(型號、品牌)之間的差異。這些差異均可以根據(jù)經(jīng)驗及相關的性能確認(PQ)進行預先估計,在估計的基礎上適當放寬考察。
3、在上述各種擬定的偏離條件下進行分離度考察,確定最差分離度,比如說是在流速2.2ml/min時分離度為最差的1.1。
4、在流速2.2ml/min,分離度為1.1的條件下,設計雜質A與雜質B的靈敏度(檢測限、定量限),線性與范圍,準確度(加標回收)試驗。此時,我們甚至可以在該條件下兼顧其他雜質的再次驗證。
5、在最差分離度條件下,各項驗證均滿足擬定的驗證要求時(不一定非得完全按照中國藥典9101的要求),可以合理的制定所希望的分離度或峰谷比。
此外,尚需說明一點的是,耐用性不是通過性驗證,無需擬定范圍后追求耐用性試驗的通過。耐用性的參數(shù)應在方法開發(fā)階段已完成邊界的探索,并進行了初步的驗證;在方法學驗證階段根據(jù)開發(fā)時的邊界,適當調整符合實際使用場景的參數(shù)偏離范圍并進一步的確認。