眾所周知,在反相液相色譜中,固定相是非極性的,而流動相是極性的。我們?nèi)绾问沽鲃酉喑蕵O性呢?通過添加水這樣的水性組分。然而,添加水的比例有限制,不能使用含水量過高的流動相進(jìn)行反相液相色譜分析,如90%、95%甚至100%。那么,這是什么原因呢?
首先,我們需要了解為什么要使用高含水量的流動相。原因可能是為了保留高極性分子,如有機(jī)酸。例如抗壞血酸,這些分子在性質(zhì)上是高極性的,它們在反相液相色譜中不會被充分保留,因為我們的固定相是非極性的,而非極性固定相不會保留這些極性化合物。因此,需要在流動相中添加高比例的水相。這是因為水是一種極性溶劑,它能夠與極性較強(qiáng)的分析物形成氫鍵或離子相互作用,從而降低分析物在流動相中的溶解度,有利于分析物在色譜柱上的保留和分離。
接下來,我們需要了解C8或C18固定相的性質(zhì)。C8/C18是一種常用的反相液相色譜柱,其表面鍵合有C8或C18烷基鏈,具有類似油脂的非極性特性。在反相色譜法中,分析物在流動相和固定相之間進(jìn)行分配,以實現(xiàn)分離。由于C8/C18柱的固定相非極性,它們通常適用于分析非極性或弱極性分析物。然而,油水不能混合,類似油脂的非極性特性使得C8或C18固定相在高比例水相中不能被潤濕。當(dāng)流動相中有一定比例的有機(jī)溶劑,如乙腈或甲醇(其性質(zhì)為非極性)時,對C8或C18具有良好的潤濕性。而鍵合的固定相是位于硅膠孔內(nèi)的,這意味流動相能夠潤濕C8或C18固定相的孔。這一點是非常重要的,否則它們將無法實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的保留。然而,如果使用100%的水相作為流動相,這會使C8或C18鍵合固定相干涸。因為水具有較高的表面張力,流經(jīng)固定相的水分子不會進(jìn)入孔內(nèi),而只會通過孔之間的空間。這樣一來,孔就不會打開,如果孔沒有被潤濕,那么固定相無法處于活躍狀態(tài),不能與分析物發(fā)生相互作用。這就是在反相液相色譜中使用C8/C18柱時要避免高水相流動相的原因。
當(dāng)C8/C18固定相暴露在高水相流動相中時,由于表面張力較高,C8/C18表面會脫水,這種現(xiàn)象稱為固定相塌陷、鏈折疊或固定相打結(jié),化合物無法正常地與固定相發(fā)生相互作用進(jìn)行保留。
那么,固定相塌陷會帶來哪些問題呢?固定相塌陷可能會導(dǎo)致保留減少、保留時間的不重復(fù)的現(xiàn)象。并且如果想再次從干涸狀態(tài)恢復(fù)到潤濕狀態(tài),這個反向過程將需要很長的時間。保留的減少是因為鍵合固定相的活性表面存在于硅膠孔中,而孔內(nèi)沒有被潤濕,化合物也無法進(jìn)入孔內(nèi)與其發(fā)生相互作用。因此,保留時間會減少。例如,如果使用90%的水和10%的甲醇作為流動相,保留時間為10分鐘。此時,如果只使用100%的水,10分鐘的保留時間會急劇減少到3~4分鐘。第二個重要的點是保留時間的重復(fù)性會降低,可能會隨著時間的推移而發(fā)生變化。所以,如果保留時間變化很大,可能是因為流動相中水含量較高。
如果別無選擇,只能使用水性或高比例水相的流動相,那么在方法開發(fā)階段,需要注意選擇合適的色譜柱。
1.未封端色譜柱。未封端柱表面存在較多的具有一定極性的游離硅醇,游離硅醇使固定相表面能被潤濕,有利于極性分析物的保留。
2.短鏈烷基色譜柱:鍵合鏈之間存在游離體積,硅醇的屏蔽作用很小,有利于極性分析物的分離。
3.極性嵌入烷基相色譜柱:在烷基鏈中嵌入極性基團(tuán),增強(qiáng)與極性分析物之間的相互作用,提高保留性能。
4.寬孔徑相色譜柱:以便水可以滲透到孔內(nèi)使相濕潤,有利于極性分析物在高水相流動相下的保留。
綜上所述,在使用C8/C18色譜柱時,應(yīng)避免高水相流動相,以免造成固定相塌陷等問題。針對高水相流動相下保留極性分析物的需求,可以選擇其他類型的色譜柱進(jìn)行分析。