適用范圍：

本思路僅適用于反向色譜法分析離子化合物方法開(kāi)發(fā)中流動(dòng)相pH的確定。

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)以或者根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)按照下圖中列出的主要酸堿官能團(tuán)在水溶液的pKa值進(jìn)行推測(cè)。

注意：按照上表中官能團(tuán)進(jìn)行估算時(shí)分子中相鄰基團(tuán)的不同會(huì)導(dǎo)致pKa出現(xiàn)1-2個(gè)單位的差異。對(duì)于酸性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致酸性增強(qiáng)，pKa值相應(yīng)降低；對(duì)于堿性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致堿性降低，pKa值相應(yīng)降低。

先看下流動(dòng)相pH對(duì)酸堿化合物的影響：

1.流動(dòng)相pH對(duì)不同pKa化合物的保留時(shí)間的影響

請(qǐng)仔細(xì)觀(guān)察上圖，通過(guò)該圖我們可以獲得以下信息：

(1)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH可改變離子化合物的保留

強(qiáng)酸及弱酸性化合物在酸性條件下會(huì)以分子形式存在，此時(shí)疏水性較高（極性大）在RPC的保留會(huì)較強(qiáng)。強(qiáng)堿及弱堿性化合物在堿性條件下多以分子形式存在，此時(shí)疏水性較高（極性大）在RPC的保留會(huì)較強(qiáng)。而中性化合物的保留基本與pH沒(méi)有關(guān)系，不隨pH的改變發(fā)生保留時(shí)間的變動(dòng)。因此我們?cè)诜椒ㄩ_(kāi)發(fā)的時(shí)候可以通過(guò)改變流動(dòng)相的pH進(jìn)行改變化合物的保留時(shí)間

(2)在pH3-9范圍內(nèi)微小的pH變化可能會(huì)引起保留時(shí)間的明顯變化，因此建議方法開(kāi)發(fā)初始pH調(diào)節(jié)范圍在2～3，這樣可以降低對(duì)pH略微變化的敏感性。

(3)如果是未知的化合物，調(diào)節(jié)pH值我們可以根據(jù)保留時(shí)間的變化推斷化合物的酸堿性，比如保留時(shí)間隨著pH的增大而延長(zhǎng)的樣品肯定是堿性化合物。

2.流動(dòng)相pH對(duì)化合物峰型的影響

根據(jù)流動(dòng)相pH對(duì)酸堿化合物的電離的影響，當(dāng)化合物的pKa與流動(dòng)相pH重合時(shí)會(huì)導(dǎo)致分子與離子形式共存，化合物的峰型不好。因此建議將pH控制在化合物的pKa±2的范圍以外，此時(shí)化合物99%基本是以分子或者離子形式存在，峰型會(huì)更加的尖銳。

3.流動(dòng)相pH對(duì)化合物的選擇性的影響

根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當(dāng)流動(dòng)相的pH約等于化合物的pKa時(shí)，可以最大限度的調(diào)整化合物的保留時(shí)間。此時(shí)改變0.1個(gè)單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個(gè)單位的變動(dòng)。但此時(shí)需要進(jìn)行精確控制流動(dòng)相的pH，這要求把流動(dòng)相pH控制在0.02個(gè)單位以?xún)?nèi)，在實(shí)驗(yàn)室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

但我們實(shí)驗(yàn)時(shí)可以將pH范圍放寬，只要將流動(dòng)相pH控制在化合物pKa值±1.5個(gè)單位的范圍內(nèi)（上圖所示的II范圍內(nèi)）就可以對(duì)化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時(shí)進(jìn)行分離選擇性較好。同時(shí)為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個(gè)單位以?xún)?nèi)(當(dāng)流動(dòng)相pH控制范圍較窄時(shí)建議使用緩沖鹽的質(zhì)量進(jìn)行控制，比pH計(jì)進(jìn)行控制效果更優(yōu))。

通過(guò)以上三點(diǎn)分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動(dòng)相的pH有很大的關(guān)系。主要依據(jù)化合物出峰時(shí)間、化合物的峰型及所需要分離目標(biāo)的化合物綜合考慮來(lái)確定流動(dòng)相的pH。

可能有的同事會(huì)發(fā)現(xiàn)第二點(diǎn)和第三點(diǎn)是有些矛盾的，這時(shí)候就需要對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步的探索，看看是否pH值會(huì)對(duì)化合物的峰型產(chǎn)生影響（有的專(zhuān)家認(rèn)為該觀(guān)點(diǎn)缺乏理論和實(shí)踐的支持）或者是否需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進(jìn)行提高選擇性。

筆者在做實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有的物質(zhì)會(huì)因稀釋液pH使用不當(dāng)產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時(shí)流動(dòng)相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時(shí)離子化合物并沒(méi)有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

1.緩沖液選擇主要依據(jù)：

（1）緩沖溶液的pKa和緩沖容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

2.對(duì)以上三點(diǎn)進(jìn)行說(shuō)明

(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動(dòng)相的pH相等時(shí)緩沖能力最大，pKa與流動(dòng)相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動(dòng)相的pH與緩沖液的pKa值不能超過(guò)±1.0個(gè)單位，當(dāng)緩沖溶液濃度較高時(shí)可以放寬范圍到1.5個(gè)單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見(jiàn)下圖：

緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過(guò)低導(dǎo)致緩沖能力不足（可通過(guò)調(diào)整進(jìn)樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說(shuō)明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致與有機(jī)相混溶時(shí)鹽的析出，對(duì)儀器、色譜柱都會(huì)產(chǎn)生損傷，而且使得基線(xiàn)不好。一般初始摸索方法時(shí)推薦使用25mmol。

（2）根據(jù)緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=7時(shí)10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時(shí)，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測(cè)試通過(guò)使用容器將不同比例的混合溶劑進(jìn)行混合，觀(guān)察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機(jī)相的含量，在梯度洗脫時(shí)尤為注意）。

（3）根據(jù)化合物的吸收波長(zhǎng)：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯(cuò)的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測(cè)波長(zhǎng)

3. 緩沖鹽的作用：

緩沖鹽的種類(lèi)或者濃度對(duì)選擇性的改變會(huì)很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時(shí)間的穩(wěn)定性。

以上就是方法開(kāi)發(fā)中流動(dòng)相pH確定的主要基本思路。筆者在做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些理論上的知識(shí)我們可能已經(jīng)知道了，但是在運(yùn)用到方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候并不是一帆風(fēng)順的。比如說(shuō)我們最近做的一個(gè)苯胺類(lèi)化合物，推測(cè)其為堿性，想象中改變流動(dòng)相的pH應(yīng)該會(huì)發(fā)生保留的變化，但是我們從酸性調(diào)節(jié)到堿性該化合物的保留卻沒(méi)有變動(dòng)，后來(lái)我們分析可能是因該化合物有較強(qiáng)的吸電子基團(tuán)導(dǎo)致堿性降低變成一個(gè)接近中性的物質(zhì)，故保留時(shí)間不再受pH的影響。

筆者相信在方法開(kāi)發(fā)時(shí)努力嘗試使用理論知識(shí)去指導(dǎo)實(shí)踐最終一定會(huì)取得較好的結(jié)果，而且會(huì)事半功倍。有時(shí)候理論無(wú)法去指導(dǎo)實(shí)踐可能是因?yàn)槲覀兊睦碚撝�識(shí)層面還沒(méi)達(dá)到，有些地方可能沒(méi)有注意到有其它條件的影響。但只要我們一直堅(jiān)持使用知識(shí)去指導(dǎo)實(shí)踐，通過(guò)實(shí)踐來(lái)驗(yàn)證所學(xué)的知識(shí)，反復(fù)的相融合，不斷的總結(jié)，落實(shí)到書(shū)面上，我們?cè)诜椒ㄩ_(kāi)發(fā)時(shí)一定會(huì)越來(lái)越順手。