一、氨基酸分析方法分類(lèi)
氨基酸分析按其分離和檢測(cè)方法的不同可分為三大類(lèi)型。第一類(lèi)是基于陽(yáng)離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測(cè)定的離子交換色譜法(IEC)。此類(lèi)方法由Stein和Moore兩人1958年發(fā)明,并于1972年獲諾貝爾獎(jiǎng),是當(dāng)今國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及仲裁和涉外的方法。第二類(lèi)是所有基于反相色譜分離、柱前衍生、熒光或紫外檢測(cè)的高效液相法(HPLC)。第三類(lèi)是陰離子交換分離直接安培法檢測(cè)的離子色譜法IC,嚴(yán)格說(shuō)來(lái),陰離子交換和陽(yáng)離子交換都叫“IEC”,在此將陰離子交換分離、安培檢測(cè)的方法歸類(lèi)為IC,是因?yàn)檫@類(lèi)儀器實(shí)際上就是離子色譜儀,只不過(guò)配置側(cè)重點(diǎn)為氨基酸分析。本文中對(duì)三類(lèi)方法多用簡(jiǎn)稱(chēng)。
說(shuō)明:
1、PITC異硫氰酸苯酯;OPA鄰苯二甲醛;FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯;AQC 6-氨基-喹啉基-N-羥基琥貝酰亞胺-氨基甲酸酯;DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯。
2、IEC法也可使用柱后OPA衍生(熒光檢測(cè)),可以降低檢測(cè)限到1pmol,但無(wú)法檢測(cè)二級(jí)氨基酸。
二、用戶(hù)如何選擇適合自己的方法和儀器
氨基酸分析的方法和儀器多種多樣,用戶(hù)應(yīng)該根據(jù)自己的實(shí)際應(yīng)用情況和發(fā)展趨勢(shì)來(lái)選擇方法和儀器。選擇時(shí)可參考以下幾個(gè)方面:
1、是否需要對(duì)分析結(jié)果負(fù)責(zé)(如對(duì)外出具報(bào)告等)
IEC儀器使用茚三酮柱后衍生法,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際仲裁標(biāo)準(zhǔn),而IC法和HPLC法雖然總體性能也比較穩(wěn)定可靠,但其測(cè)量結(jié)果與茚三酮法有較大差異,且結(jié)果難以長(zhǎng)期重復(fù),這對(duì)于仲裁不利。目前,IC法和HPLC法分析氨基酸一般僅用于不太深入的研究,而且主要是利用其靈敏度較高的特性。也有部分企業(yè)用來(lái)做內(nèi)部質(zhì)量控制(國(guó)家沒(méi)有制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)),但如果要考慮對(duì)外做樣并出具結(jié)果報(bào)告,IEC儀器是唯一選擇。由于國(guó)內(nèi)的氨基酸分析呈現(xiàn)急劇上升的勢(shì)頭,而很多單位經(jīng)濟(jì)能力有限,因此也確有不少單位購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)用氨基酸分析儀作為創(chuàng)收手段。
2、一次進(jìn)樣需要出峰的數(shù)量是多還是少
氨基酸種類(lèi)繁多、性質(zhì)接近,因此氨基酸分析是色譜界公認(rèn)的難題,盡管現(xiàn)在有多種多樣的方法,但沒(méi)有任何方法能夠保證所有氨基酸峰能夠一次進(jìn)樣完全的分離。僅僅從分離程度來(lái)說(shuō),好的HPLC方法最多可以一次分離檢測(cè)20種左右的氨基酸峰,IC法最多可一次分離檢測(cè)約30種氨基酸峰(理論上說(shuō)來(lái),IC法可達(dá)到與IEC法相當(dāng)?shù)某龇鍞?shù)量,但金電極的基線(xiàn)漂移較大,保留時(shí)間太長(zhǎng)的峰就難以定量分析),IEC法最多一次可分離檢測(cè)50種左右的氨基酸峰。從這個(gè)角度來(lái)說(shuō),如果您需要分析游離氨基酸樣品,就應(yīng)當(dāng)選擇IEC儀器。
3、氨基酸分析頻率高還是低
氨基酸樣品分析頻率如果達(dá)到每個(gè)星期至少1次,就可以算“頻率較高”,少于每周1次就可以說(shuō)是“較低”。頻率較高時(shí),應(yīng)當(dāng)儀器專(zhuān)用化(即便是用HPLC和IC法,也應(yīng)專(zhuān)用于氨基酸分析),因?yàn)榉磸?fù)更換柱子和緩沖體系不僅麻煩、平衡時(shí)間長(zhǎng),難以保證分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性,而且容易損壞儀器。
4、氨基酸樣品總量是多還是少
總體的成本應(yīng)考慮到做樣成本,而不能只看儀器本身。HPLC做氨基酸分析時(shí),每根柱子只能進(jìn)樣100~500針,而IEC儀器的柱子都超過(guò)1000針(sykam柱子使用國(guó)產(chǎn)試劑時(shí)大于4000針,使用進(jìn)口試劑時(shí)大于6000針)。
如果都使用國(guó)產(chǎn)試劑,HPLC儀器單針成本平均160元人民幣,IEC儀器單針成本平均不到20元人民幣,IC儀器單針成本平均60元人民幣(IC法無(wú)需衍生劑,但檢測(cè)電極是消耗品)。此處計(jì)算了標(biāo)樣、緩沖溶液、衍生劑、柱子等消耗品價(jià)格,而儀器的維護(hù)保養(yǎng)費(fèi)用相同(未計(jì)算)。下表是專(zhuān)用氨基酸分析儀IEC、HPLC和IC(都配置自動(dòng)進(jìn)樣,HPLC加配氨基酸分析包)的總成本分析。
也就是說(shuō),當(dāng)分析樣品量超過(guò)1000個(gè)(進(jìn)樣針數(shù)大于2500),IEC專(zhuān)用氨基酸分析儀就開(kāi)始成為費(fèi)用最低的儀器了。通常儀器的使用壽命超過(guò)8年(平均10年左右),只要每年的樣品量大于100個(gè),IEC儀器就沒(méi)有價(jià)格上的劣勢(shì)。
三、哪些儀器是“氨基酸分析儀”
我們已經(jīng)比較了HPLC、IC和IEC這三大類(lèi)氨基酸分析方法,總的說(shuō)來(lái),它們適合不同情況下的應(yīng)用,雖然IEC茚三酮柱后衍生法適應(yīng)范圍更廣泛,但儀器售價(jià)也明顯要高。目前中國(guó)市場(chǎng)上號(hào)稱(chēng)是專(zhuān)用氨基酸分析儀的有很多,對(duì)于用戶(hù)而言,也未必需要去分辯誰(shuí)是真正的專(zhuān)用氨基酸分析儀,而且國(guó)家儀器名錄甚至國(guó)際上都沒(méi)有明確提出專(zhuān)用氨基酸分析儀的定義,但在中國(guó)市場(chǎng),無(wú)論是使用者還是儀器廠家,一般都是把陽(yáng)離子交換分離、茚三酮柱后衍生法儀器叫作“氨基酸分析儀”。這類(lèi)儀器技術(shù)門(mén)檻較高,國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)有廠家生產(chǎn)此類(lèi)儀器,代表廠商有德國(guó)sykam、日本hitachi等。而IC法儀器的代表是Dionex公司的AAA-direct。
四、IEC儀器之間的比較
IEC儀器也有幾個(gè)廠家生產(chǎn),用戶(hù)該如何選擇?
第一,當(dāng)然是滿(mǎn)足分析需要的技術(shù)指標(biāo)如分離度、重復(fù)性等要求,而其中的分離度又是更為重要的指標(biāo),因?yàn)椋V理論一般以分離度達(dá)到1.2作為兩峰基本分離的判定前提,只有峰分開(kāi)了,才有意義去討論定性和定量的重復(fù)性。
第二,應(yīng)考慮儀器的可靠性。如果儀器今天堵了、明天漏了,用戶(hù)不僅要付出大量人力財(cái)力,分析結(jié)果的可信度也將大打折扣。
第三,應(yīng)考慮儀器的運(yùn)行成本。例如是否可以使用國(guó)產(chǎn)試劑、柱子壽命(以多少次進(jìn)樣計(jì)算、而不以多少年計(jì)算)等。
第四,應(yīng)考慮儀器設(shè)計(jì)是否有利于氨基酸分析,例如是否有惰性氣體保護(hù)(茚三酮極易被氧化)、是否提供在線(xiàn)脫氣、是否提供溶液和樣品的制冷控制等。
第五,應(yīng)考慮售后服務(wù)。分析過(guò)程中遇到困難是在所難免,廠家必須能夠快速響應(yīng)、盡快解決問(wèn)題。另外,常用備件的價(jià)格也是一個(gè)重要因素,因?yàn)橛脩?hù)在購(gòu)買(mǎi)前一般難以注意到售后的問(wèn)題,而很多廠家也沒(méi)有公示自己的常用備件價(jià)格,這就為將來(lái)的使用埋下了隱患,事實(shí)上,也的確有很多儀器(尤其是進(jìn)口儀器)在出現(xiàn)一些看似微小的故障之后,就因?yàn)榫S修費(fèi)用太高而被“束之高閣”。