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    72型分光光度計(jì)原理

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2010-12-24
    核心提示:72型分光光度計(jì) 原理

    一、構(gòu)造原理及結(jié)構(gòu)

    72型分光光度計(jì)是可見光分光光度計(jì),波長范圍為420nm~700nm,它由三大部分組 成:磁飽和穩(wěn)壓器、光源、單色光器和測光機(jī)構(gòu)、微電計(jì)。
    72型分光光度計(jì)的基本依據(jù)是朗伯—比耳定律,它是根據(jù)相對測量原理工作的,即先選定某一溶劑作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,設(shè)定其透光率為100%,被測試樣的透光率是相對于標(biāo)準(zhǔn)溶液而言的,即讓單色光分別通過被測試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液,二者能量的比值就是在一定波長下對于被測試樣的透光率。如圖所示,白色光源經(jīng)入射狹縫、反射鏡和透光鏡后,變成平行光進(jìn)入棱鏡,色散后的單色光經(jīng)鍍鋁的反射鏡反射后,再經(jīng)過透鏡并聚光于出射狹縫上,狹縫寬度為0.32nm。反射鏡和棱鏡組裝在一可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上并由波長調(diào)節(jié)器的凸輪所帶動(dòng),轉(zhuǎn)動(dòng)波長調(diào)節(jié)器便可以在出光狹縫后面選擇到任一波長的單色光。單色光透過樣品吸收池后由一光量調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)為適度的光通量,最后被光電電池吸收,轉(zhuǎn)換成電流后由微電計(jì)指示,從刻度標(biāo)尺 上直接讀出透光率的值。
     
    分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

    二、分光光度計(jì)的簡單原理

    分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計(jì)算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

    1、核酸的定量
    核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如:1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

    事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)定。

    從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計(jì)的測試范圍)。最后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

    除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如 A 260 / A 280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm。純凈的樣品,比值大于 1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A 320 一般是 0。

    2、蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
    這種方法是在280 nm波長,直接測試蛋白。選擇 Warburg公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

    蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320 nm的“背景”信息,設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A,最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不超過 1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。
    漂移的原因是因?yàn)?Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì)被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

    蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA 的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

    3、比色法蛋白質(zhì)定量
    蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

    比色方法一般有 BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
    Lowry 法:以最早期的 Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與 Biuret相比,Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
    BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生 Cu+,后者與 BCA 形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng),反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于 Lowry 法,操作簡單,敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

    Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特點(diǎn)是,敏感度好,是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2倍;操作更簡單,速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),方便結(jié)果;而且與一系列干擾 Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無可比性。

    某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller 等測試人奶中的蛋白,結(jié)果 Lowry,BCA測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),以 BSA 作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度1.34 mg / ml,以 a 球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度 2.64 mg /ml。因此,在選擇比色法之前,最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間,所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品),都必須在此時(shí)間內(nèi)測試。時(shí)間過長,得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色,導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。

    細(xì)菌細(xì)胞密度(OD 600)
    實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期,多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,與培養(yǎng)基反應(yīng),發(fā)生變色反應(yīng)。另外,需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。

    分光光度計(jì)的重要配件 —— 比色杯
    比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積,有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不適合比色法測定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著色,所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。

    由于另外測試的樣品量不同,所以一般分光光度計(jì)廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量,亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯,樣品用量僅需50μl,比色杯單個(gè)無菌包裝,可以回收樣品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯,是目前比色杯市場上一個(gè)革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展,對此類科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求,分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可缺少的儀器,也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的必備設(shè)備之一。 
     

    編輯:songjiajie2010

     
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