1. 取RNA

2. 將電泳槽和板，梳齒浸泡在3%H2O2中20-30分鐘，并吹干

3. 跑1%瓊脂糖凝膠，檢測(cè)樣本RNA含量

4. 變性膠

在桌面上利用保險(xiǎn)膜鋪出一塊干凈的區(qū)域，將1.95g 瓊脂糖加入110ml 的 DEPC-H2O （加熱前可在三角瓶上做一個(gè)記號(hào)，在加熱后把蒸發(fā)的水分補(bǔ)足）加熱沸騰，冷卻（補(bǔ)水）至60度左右。加入15ml 10xMOPS (PH8.0)和25ml 甲醛，混勻后倒膠，冷卻待用。

5． 電泳液（1L）

100ml 10xMOPS (PH7.0)

800ml DEPC-H2O

100ml 甲醛

6． sample buffer(-70度保存)

1650 μl 體系：

200μl 10xMOPS (PH8.0)

350μl 甲醛

1ml 甲酰胺

100μl loading buffer(DNA用染料)

用槍吹吸混勻

以樣品RNA : sample buffer= 1:3 (v:v) 的比例加入 （RNA marker 同樣）

點(diǎn)樣前 68℃ 5分鐘（RNA marker 同樣）

7．跑電泳

120-150V，大約4-6小時(shí)（跑到整塊膠還剩下1/3）每半個(gè)小時(shí)吸一次陽(yáng)極的電泳液到陰極（平衡酸堿性），將膠切下。如加RNA marker 則用EB染5’，洗20’，將膠切去一個(gè)角作為位置記號(hào)。

8. 轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜液： 20xSSC:

1000ml體系：

175.3g NaCl

88.2g 檸檬酸納

NaOH 調(diào)節(jié)到PH7.0

定容

搭建鹽橋：將20XSSC倒入白磁盤(pán)中，上擔(dān)一塊玻璃板，用一張大濾紙，兩邊浸入白盤(pán)中SSC，注意：防止短路，接觸面不能有氣泡，上反放膠，覆與膠等大的尼龍膜，再覆等大的濾紙，再壓上一疊吸水紙，壓上重物。

9． 壓膜16h以上，期間要換吸水紙。紫外交聯(lián)2’。7XSSC洗15’。用濾紙包膜，以培養(yǎng)皿壓住。

10． 烘膜

80℃ 2h

舊膜以煮沸的洗膜液洗脫兩次，10’每次輕柔震蕩。

11.預(yù)雜交

先用水沖洗雜交管，再用洗膜液沖洗。

加5ML 預(yù)雜交液（雜交液沒(méi)過(guò)膜即可）于雜交管中，將膜小心放入用雜交液將膜浸潤(rùn)，使其貼在管壁上，不可有氣泡，有DNA的一面朝向管內(nèi)，放入雜交爐中55度轉(zhuǎn)3hr以上，（舊膜半小時(shí)）

12. 探針標(biāo)記

1． 做柱子

用燒紅的針頭將0.5ml的離心管底部戳一個(gè)小洞，加入玻璃纖維將開(kāi)口堵住，入Sephadex G50 3000rpm 5’，待液體流盡后，加入TE洗滌三次（3000rpm 5’）。

2． 標(biāo)探針

在離心管中加入探針約2ul（20-70ng, 太多會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性吸收同位素），

oligo(kit1) 2μl

buffer(kit2) 2.5μl，

雙蒸水12.5μl，

100℃ 5’，0℃ 5’

再加入dNTP(kit4) 2.5μl.

Klenow 1μl

雙蒸水6ul

-p32-dCTP 1.5μl,

37℃水浴 20-30’

加入TE 100μl，過(guò)柱純化，套上大1.5ML 安培管，3000 rpm 3-5min , 再加入100μl TE 洗柱子3000 rpm 3min, 加入4μl 6N NaOH 室溫變性5min(可先將NaOH加入管中)

5．雜交

將探針加入雜交管中（注意不要加在膜上）65℃雜交過(guò)夜（大于16小時(shí)），膜不能干掉。

6．洗膜

室溫下用少量洗膜液洗滌雜交膜3-5min，注意回收放射性洗液，倒入洗膜液，65℃ 10min 回收洗液，用放射性計(jì)數(shù)器測(cè)一下放射強(qiáng)度，視放射強(qiáng)度，然后重復(fù)1-2次。

7．壓磷屏

用保鮮膜將膜包好（液體要吸干），壓磷屏20hr左右，掃描觀察。