一、酵母DNA微量制備(40ml)
1.在125ml三角瓶中用40ml YPD培養(yǎng)液在30℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)最大生長量(過夜)。
2.將上述培養(yǎng)物移入螺蓋離心管,用醫(yī)用離心機或Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘,棄去上清液。
3.將細(xì)胞懸浮在3ml的0.9mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中。
4.加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T,置37℃條件保溫1小時。
5.用醫(yī)用離心機或Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以5000r/min離心5分鐘,棄去上清液。
6.將細(xì)胞重新懸浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸鈉溶液中。
7.加0.5ml的10%十二烷基硫酸鈉(SDS),混勻。
8.置65℃保溫30分鐘。
9.加1.5ml的5mol/L醋酸鉀溶液,在冰浴上放置1小時。
10.用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心10分鐘。
11.將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的塑料離心管中,室溫下加入兩倍體積的95%乙醇,混勻,以5000~6000r/min離心15分鐘。
12.棄上清液,將沉淀物干燥,然后懸浮在3ml TE緩沖液(pH7.4)中,此操作可能需要幾個小時。
13.用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘,將上清液轉(zhuǎn)移到一個新試管,棄沉淀物。
14.加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液,在37℃下保溫30分鐘。
15.加入一倍體積的100%異丙醇,輕輕混勻,取出呈松散纖維狀的沉淀物,無需離心,讓其自然干燥。
16.將沉淀物懸浮在0.5ml TE緩沖液(pH7.4)中,置4℃保存。酵母DNA的最終濃度約為200μg/ml。如果最后的溶液混濁不清,用異丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS-34轉(zhuǎn)頭以1000r/min離心15分鐘。
二、酵母DNA微量制備(5ml)
1.按酵母于5ml YPD中,置30℃培養(yǎng)過夜。
2.用醫(yī)用離心機以2000r/min離心5分鐘沉淀細(xì)胞,棄上清液。
3.將細(xì)胞懸浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)緩沖液中,轉(zhuǎn)動一支1.5ml離心管中。
4.加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液,置37℃保溫1小時。
5.離心1小時。
6.棄上清液,把細(xì)胞懸浮在.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na2EDTA溶液。
7.加0.05ml的10% SDS,混勻。
8.置65℃保溫混合物30分鐘。
9.加0.2ml的5mol/L醋酸鉀,把離心管在冰浴中放置1小時。
10.離心5分鐘。
11.將上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈微型離心管,室溫下加入等體積的無水異丙醇,混勻,放置5分鐘。短暫離心(10秒鐘)棄上清液,讓沉淀自然干燥。
12.用0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮沉淀。
13.加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液,置37℃保溫30分鐘。
14.加0.03ml的3mol/L醋酸鈉,混勻,用0.2ml的無水異丙醇沉淀,再短暫離心收集DNA。
15.棄上清液,自然干燥,用0.1~0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮DNA。
16.在使用限制性內(nèi)切酶酶解DNA之前,有必要將最終濃度溶液離心較長時間(15分鐘)以便除去可能抑制酶解的不溶性物質(zhì)。
三、10分鐘制備酵母DNA方法
大腸桿菌或酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的制備
1.在質(zhì)粒DNA選擇性培養(yǎng)基中,置30℃培養(yǎng)少量培養(yǎng)物過夜。
2.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一支1.5ml的微型離心管,離心5秒,收集細(xì)胞。
3.小心傾去上清液,輕彈離心管,使沉淀重新懸浮于殘余培養(yǎng)液中。
4.加入0.2ml的2% Triton X-100,1%SDS,100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8),1mmol/L Na2EDTA;加入0.2ml的苯酚:氯仿:已戊醇(25:24:1);加入0.3g酸洗過的玻珠。
5.振蕩2分鐘。
6.離心5分鐘。
7.用1~5μl含DNA的水相轉(zhuǎn)化0.2ml的大腸桿菌受體菌,用15μl水相轉(zhuǎn)化酵母菌。
用于Southern分析的基因組DNA分離
1.用YPD培養(yǎng)基,置30℃培養(yǎng)10ml酵母至最大生長量。
2.用醫(yī)用離心機離心2分鐘,棄上清液,收集細(xì)胞,用0.5ml蒸餾水重新懸浮,將細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5ml微型離心管中,離心5秒收集細(xì)胞。
3.重復(fù)第二步。
4.重復(fù)第二步。
5.加0.2ml TE緩沖液(pH8),振蕩3~4分鐘。
6.離心5分鐘,將水相移至潔凈試管,加1ml的無水乙醇,上下倒置,混合均勻。
7.離心2分鐘,棄上清液,懸浮在0.4ml TE緩沖液和3μl的10mg/ml的RNase A溶液,置37℃保溫5分鐘,加入10μl 4mol/L醋酸銨和1ml的無水乙醇,上下倒置,混勻。
8.離心2分鐘,棄上清液,自然干燥后,用50μl的TE緩沖液懸浮,每份樣品用10μl進行Southern印跡分析,每份用量約2~4μg DNA。
四、酵母基因組DNA:玻珠制備法
1.用5ml培養(yǎng)基在30℃下,搖床培養(yǎng)過夜。
2.轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至13mm×100mm的玻璃離心管中,用臺式離心機以1500r/min離心5分鐘,收集細(xì)胞。
3.用3ml無菌水洗細(xì)胞,同上離心。
4.用500μl裂解緩沖液再次懸浮。
5.加入干凈玻珠(約1.5ml Eppendorf離心管的2/3體積)和25μl的5mol/L NaCl。
6.以最高速振蕩1分鐘。
7.用2000r/min離心2分鐘。
8.用P-1000移液器轉(zhuǎn)移上清液至一支1.5ml的離心管。
9.加入500μl苯酚,振蕩,離心1分鐘。用P-1000移液器吸取水相,轉(zhuǎn)移至潔凈離心管,加入500μl SEVAG(氯仿:已戊醇,24:1),同上振蕩,離心,抽提。
10.加入1ml的95%的冷凍乙醇,在-20℃下沉淀1小時。
11.以最高轉(zhuǎn)速離心沉淀DNA,棄上清液,用70%乙醇清洗,最后懸浮在250μl TE緩沖液中。
12.加25μl的EDTA-Sark和5μl的蛋白酶K(10mg/ml),置37℃保溫30分鐘。
13.加250μl的5mol/L醋酸銨,重復(fù)9、10步驟。
14.收集DNA,用70%乙醇洗,懸浮于100μl的TE緩沖液。