Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù),在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段,然后經(jīng)堿變性,Tris緩沖液中和,高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上,烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交,利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置,從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
(1)瓊脂糖凝膠電泳:利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段(0.3~25kb)分離開(kāi)。分離大分子DNA片段(800~12000bp)用低濃度瓊脂糖(0.7%),分離小分子片段(500~1000bp)用高濃度瓊脂糖(1.0%),300~5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠,根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同,可選用不同規(guī)格的電泳槽。
電泳時(shí),同時(shí)將標(biāo)記物加到旁邊孔中,便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過(guò)夜。電泳畢,將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min,也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中,在254nm短波透射燈下拍照,加橙黃色濾色鏡,使用高速一次成像膠片,光圈f4.5,曝光20~40s。
。2)硝酸纖維素濾膜吸印。
①將膠切成合適大小,切去右上角作為記號(hào)。
、趯⒛z放進(jìn)盛有變性緩沖液(1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH)的盤(pán)中輕搖動(dòng)15min。
③換到中和緩沖液(1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中輕搖動(dòng)30min。
、懿靡粡埾跛崂w維素膜,2~4張3MM濾紙和一些吸印紙(可用衛(wèi)生紙),都與膠的大小相同(硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大,否則易形成旁路),先將硝酸纖維素膜浸到水中,再放入10×SSC中,接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴橡膠手套操作。
⑤平盤(pán)上放一塊比膠大的平板(盛膠槽翻過(guò)來(lái)即可),上面鋪一張3MM濾紙,起燈芯作用,盤(pán)中加少量10×SSC緩沖液(2.5cm厚),不能沒(méi)過(guò)平板,使3MM濾紙充分飽和。
⑥將膠倒扣到3MM濾紙上。
、呓䴘竦南跛崂w維素鋪在膠上,對(duì)齊,鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下,防止產(chǎn)生氣泡,有氣泡時(shí),可用吸管趕出,不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
、嗄ど戏乓粡3MM濾紙,不能與膠接觸。
⑨上面加吸印紙及重物(500g左右)。
、馔ㄟ^(guò)濾紙的灶芯作用,平盤(pán)中的緩沖液就會(huì)通過(guò)膠上移,從而將DNA吸印到膜上,及時(shí)更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉(zhuǎn)印過(guò)夜。
、先コ厦娴臇|西,用鑷了將膜取出,在6×SSC中洗一下(也可不洗)。
⑿自然干燥,80℃烤2h。
、堰@時(shí)的膜就可進(jìn)行雜交,或室溫密封保存。