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    離心分離方法

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

      (一)差速離心法

      它利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力,使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi),然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心,分離出第二部分沉淀,如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速,逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。

      差速離心的分辨率不高,沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi),常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

     。ǘ┧俾蕝^(qū)帶離心法

      速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等),待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間,同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處(X1)的介質(zhì)密度最小,離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處(X2)介質(zhì)的密度最大,但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度,即ρP>ρm。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶,達(dá)到彼此分離的目的。梯度液在離心過(guò)程中以及離心完畢后,取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用,避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。

      由于ρP>ρm可知S>0,因此該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制,既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶,又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng),所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部;離心時(shí)間不足,樣品還沒(méi)有分離。由于此法是一種不完全的沉降,沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大,一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

     。ㄈ┑让芏入x心法

      等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度,此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度,待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合,離心開(kāi)始后,當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度,與此同時(shí)原來(lái)分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度,即ρm>ρP時(shí)粒子上;在彎頂處ρP>ρm時(shí),則粒子沉降,最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即ρP=ρm,此時(shí)dx/dt為零粒子不再移動(dòng),粒子形成純組份的區(qū)帶,與樣品粒子的密度有關(guān),而與粒子的大小和其他參數(shù)無(wú)關(guān),因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。

      此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近,而密度差異較大時(shí)。常用的梯度液是CsCl。

     。ㄋ模┨荻热芤旱闹苽

     、碧荻炔牧系倪x擇原則作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn):①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性,且易與所分離的生物粒子分開(kāi)。②可達(dá)到要求的密度范圍,且在所要求的密度范圍內(nèi),粘度低,滲透壓低,離子強(qiáng)度和pH變化較小。③不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化,價(jià)格便宜或容易回收。⑤濃度便于測(cè)定,如具有折光率。⑥對(duì)于超速離心分析工作來(lái)說(shuō),它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件,完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒(méi)有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料:①糖類:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原。②無(wú)機(jī)鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等。③有機(jī)碘化物:三碘苯甲酰葡萄糖胺(matrizamide)等。④硅溶膠:如Percoll。⑤蛋白質(zhì):如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機(jī)物:如氟代碳等。

     、蔡荻炔牧系膽(yīng)用范圍

     、耪崽牵核苄源,性質(zhì)穩(wěn)定,滲透壓較高,其最高密度可達(dá)1.33g/ml,且由于價(jià)格低容易制備,是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料,但由于有較大的滲透壓,不宜用于細(xì)胞的分離。

      ⑵聚蔗糖:商品名Ficoll,常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000,F(xiàn)icoll滲透壓低,但它的粘度卻特別高,為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。

      ⑶氯化銫:是一種離子性介質(zhì)、水溶性大,最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類,在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率,被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離,但價(jià)格較貴。

      ⑷鹵化鹽類:KBr和NaCl可用于脂蛋白分離,KI和NaI可用于RNA分離,其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白,NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

     、蒔ercoll:是商品名,它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP),滲透壓低,它對(duì)生物材料的影響小,而且顆粒穩(wěn)定,在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的,其粘度高,且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。

     

     

     
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