原 理
將血清脂蛋白用脂類染料(如蘇丹黑或油紅O等)進行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行電泳分離。通電后,脂蛋白向正極移動,并分離為幾個區(qū)帶。
操 作
1.預(yù)染血清:血清0.2ml加蘇丹黑染色液0.2ml于小試管中,混合后置37℃水浴染色30分鐘,然后離心(2000轉(zhuǎn)/分,約5分鐘)。
2.制備瓊脂糖凝膠板:將已配制的0.45%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化,用吸管吸取凝膠溶液澆注載玻片,每片2.5ml,靜置約半小時后凝固(天熱時需延長,可放冰箱數(shù)分鐘加速凝固)。
3.點加血清:已凝固的瓊脂糖凝膠板的一端約2cm處,用切口刀片垂直切入凝膠后立即取出,然后用銅絲小匙將長方小條凝膠取出。以小片濾紙吸干小槽中水分,用血色素吸管吸取經(jīng)過預(yù)染的血清約15μl,注入凝膠板上的小槽內(nèi)。
4.電泳:將加過血清的凝膠板平行放入電泳槽中,樣品應(yīng)在陰極一端。兩塊三層紗布于巴比妥緩沖液中浸潤,然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端,紗布的另一端浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液(注意:此電極緩沖液不能用三羥甲烷緩沖液代替)。接通電源,電壓為120~130V,每片電流為3~4mA。約經(jīng)電泳15至55分鐘,即可見分離之色帶。
結(jié)果及臨床意義
1.正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)三條區(qū)帶,從負極到正極依次為β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最淺)、α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點處應(yīng)無乳糜微粒。
2.如果前β-脂蛋白比α-脂蛋白深,結(jié)合血清甘油三酯明顯升高和膽固醇正;蚵愿撸梢远棰粜透咧鞍籽Y。
3.如果β-脂蛋白區(qū)帶比正常血清明顯深染者,同時結(jié)合血清總膽固醇明顯增高、甘油三酯正常者為Ⅱa型;若結(jié)合血清總膽固醇增高而甘油三酯略高的前β略溶者為Ⅱb型。
4.結(jié)果β-和前β-兩區(qū)帶分離不開連在一起稱“寬β區(qū)帶”,結(jié)合血清甘油三酯和膽固醇均有所增高,可定為Ⅲ型。
5.如果原點出現(xiàn)乳糜微粒,β,前β均正;驕p低,結(jié)合血清甘油三酯明顯升高,可定為Ⅰ型。
注意事項
1.電泳樣品要求為新鮮的空腹血清。
2.每一塊凝膠上可平行挖兩條小槽,因而可加兩個樣品。
3.如果用一形狀大小和小槽一樣的有機玻璃片,在瓊脂糖膠凝固前固定于適當(dāng)位子上,當(dāng)凝固后取出有機玻璃片,凝膠板上留下小槽可直接加樣,不需挖槽。
4.如果需要保留電泳樣本,可將電泳后之凝膠板(連同玻片)放于清水中浸泡脫鹽2小時,然后放烘箱(80℃左右)烘干即可。
試劑與器材
1.巴比緩沖液(pH8.6,離子強度0.075):為電極緩沖液
巴比妥鈉15.4g,巴比妥2.76g,EDTA酸0.292g,加水溶解后加水至1000ml
2.三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.6)為凝膠緩沖液
三甲基氨基甲烷1.212g,EDTA酸0.29g,NaCl 15.85g加水溶解后加水至1000ml
3.瓊脂糖凝膠
瓊脂糖0.45g,三痙甲基氨基甲烷緩沖液50ml,水50ml
加熱至沸,待瓊脂糖溶解后立即停止加熱。
4.挖槽工具制作
切口刀:刀口長15mm的刀片,中央夾一有機玻璃或木片,用螺絲固定,使兩刀片相距1.5mm。挖槽小匙:用直徑1.5mm的銅絲約6cm長,一端錘成扁平,用砂紙磨光。
5.電泳槽和電泳儀:同血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的儀器。