手機版
絕大多數(shù)細菌在適宜的條件下可以生長，細菌感染性患者標本只有經(jīng)過細菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗，才可對感染性疾病進行病原學診斷并指導臨床用藥。因此，細菌培養(yǎng)對疾病的診斷、預防和治療具有重要的作用。
細菌分離培養(yǎng)主要用于臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。通過分離，可使細菌在平板上分散生長，便于觀察單個菌落特性，也易于挑取單個菌落，進行生化鑒定。
一、基本條件
細菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無菌室和超凈工作臺等。
(一)接種用具
包括接種環(huán)和接種針兩類。接種環(huán)用來挑取標本、菌液及平板劃線等。接種針則用來挑取單個菌落，穿刺高層瓊脂等。接種環(huán)(針)由環(huán)(針)、金屬柄和絕緣柄3部分組成，環(huán)(針)一般采用鉑絲制作最佳，其硬度適宜，易于傳熱，火焰滅菌后冷卻快，經(jīng)久耐用。但因其價格昂貴，目前多用電熱(鎳)絲及l(fā)次性塑料接種環(huán)代替。
接種環(huán)的直徑一般為2～4mm，長5～8cm，定量接種環(huán)容量為1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培養(yǎng)。
(二)培養(yǎng)箱
1．普通培養(yǎng)箱 可自動調節(jié)培養(yǎng)溫度(一般為35～37℃)，用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。
2．二氧化碳培養(yǎng)箱 可自動調節(jié)二氧化碳濃度(一般為5％～l0％)和培養(yǎng)溫度，用于分離培養(yǎng)嗜血桿菌和奈瑟菌等生長時需二氧化碳的細菌，尤其是初次分離培養(yǎng)時。如無二氧化碳培養(yǎng)箱時，也可用燭缸法代替。
3．厭氧袋、厭氧罐(盒)和厭氧手套箱用于分離培養(yǎng)厭氧菌。厭氧袋為透明的、不透氣的塑料袋。厭氧罐為密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化學方法去除袋、罐中的氧氣，達到無氧狀態(tài)。厭氧手套箱則可通過換氣裝置快速達到、持續(xù)保持無氧狀態(tài)，并自動調節(jié)培養(yǎng)溫度，還可通過手套在箱內進行分離接種、生化鑒定等操作。
(三)培養(yǎng)基
培養(yǎng)基(culture medium)是由人工方法配制而成的，適合微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細菌的生理、化學特性，是對病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。培養(yǎng)基按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按其用途分為基礎、營養(yǎng)、選擇、鑒別和特殊培養(yǎng)基。
1．基礎培養(yǎng)基(based medium) 含有基礎生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨�；A培養(yǎng)基廣泛用于細菌的增菌、檢驗，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎成分。
2．營養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrient medium) 在基礎培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、生長因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細菌和需要特殊生長因子的細菌生長。最常用的是血瓊脂平板、巧克力平板等。
3．選擇培養(yǎng)基(selective medium) 在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制物質，有利于目的菌的檢出和識別，而抑制其他非目的菌。例如，麥康凱瓊脂平板可以抑制球菌及革蘭陽性桿菌生長，有利于腸道菌生長，稱弱選擇性培養(yǎng)基；SS瓊脂平板除有上述作用外，還可
抑制腸道非致病菌的生長，故稱強選擇性培養(yǎng)基。
4．鑒別培養(yǎng)基(differential medium)利用細菌分解糖類和蛋白質的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用于觀察細菌各種生化反應，以鑒別和鑒定細菌。例如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(美藍)瓊脂等。
5．特殊培養(yǎng)基(special medium) 包括厭氧培養(yǎng)基和細菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基，除含營養(yǎng)成分外，還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢。后者是針對細胞壁缺損的細菌L型，由于胞內滲透壓較高，故培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。
二、接種分離技術
為了從臨床標本中分離出病原菌并進行準確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標本的來源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。
（一）平板劃線分離法
使標本或培養(yǎng)物中混雜的多種細菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落。一般要求單個菌落是一種細菌的純培養(yǎng)。但很多情況下單個菌落并非只有一種細菌，特別是標本直接劃線的開始區(qū)域生長的單個菌落分離結果不純，一般選擇菌落形成較稀少區(qū)域的單個菌落，必要時先稀釋標本再劃線。待菌落長出，后，挑選單個菌落，轉種到另一培養(yǎng)基中，繼續(xù)實驗。平板劃線法可分為以下幾種：
1．分區(qū)劃線法此法多用于糞便等含菌量較多的標本。先將標本均勻涂于平板表面邊緣一小部分(第1區(qū))；然后燒灼接種環(huán)，將環(huán)通過第l區(qū)3～4次，連續(xù)劃線(為第2區(qū))；依次劃3、4區(qū)。平板上每l區(qū)的細菌數(shù)會逐漸減少，直至分離出單個菌落(圖5-4)。
2．連續(xù)劃線法 本法一般用于接種含菌數(shù)量相對較少的標本或培養(yǎng)物。先將標本均勻涂布于平板邊緣一小部分，并由此開始，在平板表面連續(xù)劃線并逐漸下移，直至劃滿平板表面。
3．棋盤格劃線法此法多用于含菌量較多的臨床標本，如痰、糞便等標本的初代分離培養(yǎng)。其優(yōu)點是整個平板的3/4～4/5區(qū)
域(即棋盤格范圍)均為有效分離區(qū)。將標本涂布于平板約l/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自原處做平行劃線5～6條。接種環(huán)燒灼后冷卻，劃垂直線5～6條，形成正方形格；再以同法劃兩排斜線，使呈棋盤形。
(二)斜面接種法
該法主要用于純種增菌及保存菌種。挑取單個菌落從斜面底部自下向上劃一條直線，再從底部開始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。
(三)液體接種法
以接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體應淹沒接種物為準)。多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基的接種。
(四)穿刺接種法
此法用于保存菌種、觀察動力及某些生化反應。以接種針挑取細菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。其他操作與斜面接種類似。
(五)傾注平板法
取純培養(yǎng)物的稀釋液或原標本，混勻于已融化并冷卻到50℃左右15ml的瓊脂管中，無菌法傾注于無菌平皿，凝固后培養(yǎng)，進行菌落計數(shù)。該法適用于兼性厭氧菌或厭氧菌稀釋定量培養(yǎng)，也用于飲料、牛乳和尿液等液體標本活細菌計數(shù)。
細菌分離培養(yǎng)主要用于臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。通過分離，可使細菌在平板上分散生長，便于觀察單個菌落特性，也易于挑取單個菌落，進行生化鑒定。
一、基本條件
細菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無菌室和超凈工作臺等。
(一)接種用具
包括接種環(huán)和接種針兩類。接種環(huán)用來挑取標本、菌液及平板劃線等。接種針則用來挑取單個菌落，穿刺高層瓊脂等。接種環(huán)(針)由環(huán)(針)、金屬柄和絕緣柄3部分組成，環(huán)(針)一般采用鉑絲制作最佳，其硬度適宜，易于傳熱，火焰滅菌后冷卻快，經(jīng)久耐用。但因其價格昂貴，目前多用電熱(鎳)絲及l(fā)次性塑料接種環(huán)代替。
接種環(huán)的直徑一般為2～4mm，長5～8cm，定量接種環(huán)容量為1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培養(yǎng)。
(二)培養(yǎng)箱
1．普通培養(yǎng)箱 可自動調節(jié)培養(yǎng)溫度(一般為35～37℃)，用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。
2．二氧化碳培養(yǎng)箱 可自動調節(jié)二氧化碳濃度(一般為5％～l0％)和培養(yǎng)溫度，用于分離培養(yǎng)嗜血桿菌和奈瑟菌等生長時需二氧化碳的細菌，尤其是初次分離培養(yǎng)時。如無二氧化碳培養(yǎng)箱時，也可用燭缸法代替。
3．厭氧袋、厭氧罐(盒)和厭氧手套箱用于分離培養(yǎng)厭氧菌。厭氧袋為透明的、不透氣的塑料袋。厭氧罐為密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化學方法去除袋、罐中的氧氣，達到無氧狀態(tài)。厭氧手套箱則可通過換氣裝置快速達到、持續(xù)保持無氧狀態(tài)，并自動調節(jié)培養(yǎng)溫度，還可通過手套在箱內進行分離接種、生化鑒定等操作。
(三)培養(yǎng)基
培養(yǎng)基(culture medium)是由人工方法配制而成的，適合微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細菌的生理、化學特性，是對病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。培養(yǎng)基按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按其用途分為基礎、營養(yǎng)、選擇、鑒別和特殊培養(yǎng)基。
1．基礎培養(yǎng)基(based medium) 含有基礎生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨�；A培養(yǎng)基廣泛用于細菌的增菌、檢驗，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎成分。
2．營養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrient medium) 在基礎培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、生長因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細菌和需要特殊生長因子的細菌生長。最常用的是血瓊脂平板、巧克力平板等。
3．選擇培養(yǎng)基(selective medium) 在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制物質，有利于目的菌的檢出和識別，而抑制其他非目的菌。例如，麥康凱瓊脂平板可以抑制球菌及革蘭陽性桿菌生長，有利于腸道菌生長，稱弱選擇性培養(yǎng)基；SS瓊脂平板除有上述作用外，還可
抑制腸道非致病菌的生長，故稱強選擇性培養(yǎng)基。
4．鑒別培養(yǎng)基(differential medium)利用細菌分解糖類和蛋白質的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用于觀察細菌各種生化反應，以鑒別和鑒定細菌。例如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(美藍)瓊脂等。
5．特殊培養(yǎng)基(special medium) 包括厭氧培養(yǎng)基和細菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基，除含營養(yǎng)成分外，還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢。后者是針對細胞壁缺損的細菌L型，由于胞內滲透壓較高，故培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。
二、接種分離技術
為了從臨床標本中分離出病原菌并進行準確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標本的來源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。
（一）平板劃線分離法
使標本或培養(yǎng)物中混雜的多種細菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落。一般要求單個菌落是一種細菌的純培養(yǎng)。但很多情況下單個菌落并非只有一種細菌，特別是標本直接劃線的開始區(qū)域生長的單個菌落分離結果不純，一般選擇菌落形成較稀少區(qū)域的單個菌落，必要時先稀釋標本再劃線。待菌落長出，后，挑選單個菌落，轉種到另一培養(yǎng)基中，繼續(xù)實驗。平板劃線法可分為以下幾種：
1．分區(qū)劃線法此法多用于糞便等含菌量較多的標本。先將標本均勻涂于平板表面邊緣一小部分(第1區(qū))；然后燒灼接種環(huán)，將環(huán)通過第l區(qū)3～4次，連續(xù)劃線(為第2區(qū))；依次劃3、4區(qū)。平板上每l區(qū)的細菌數(shù)會逐漸減少，直至分離出單個菌落(圖5-4)。
2．連續(xù)劃線法 本法一般用于接種含菌數(shù)量相對較少的標本或培養(yǎng)物。先將標本均勻涂布于平板邊緣一小部分，并由此開始，在平板表面連續(xù)劃線并逐漸下移，直至劃滿平板表面。
3．棋盤格劃線法此法多用于含菌量較多的臨床標本，如痰、糞便等標本的初代分離培養(yǎng)。其優(yōu)點是整個平板的3/4～4/5區(qū)
域(即棋盤格范圍)均為有效分離區(qū)。將標本涂布于平板約l/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自原處做平行劃線5～6條。接種環(huán)燒灼后冷卻，劃垂直線5～6條，形成正方形格；再以同法劃兩排斜線，使呈棋盤形。
(二)斜面接種法
該法主要用于純種增菌及保存菌種。挑取單個菌落從斜面底部自下向上劃一條直線，再從底部開始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。
(三)液體接種法
以接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體應淹沒接種物為準)。多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基的接種。
(四)穿刺接種法
此法用于保存菌種、觀察動力及某些生化反應。以接種針挑取細菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。其他操作與斜面接種類似。
(五)傾注平板法
取純培養(yǎng)物的稀釋液或原標本，混勻于已融化并冷卻到50℃左右15ml的瓊脂管中，無菌法傾注于無菌平皿，凝固后培養(yǎng)，進行菌落計數(shù)。該法適用于兼性厭氧菌或厭氧菌稀釋定量培養(yǎng)，也用于飲料、牛乳和尿液等液體標本活細菌計數(shù)。
