ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用,但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大,如不注意,有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)如下,以期給同行帶來一些啟發(fā),提高試驗質(zhì)量。
下面分析Elisa試驗操作中可能影響結(jié)果的原因,并給出相應(yīng)的解決辦法。
1 選擇試劑 選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑,嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作,操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
2 加樣 可能原因:
1)血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣;
2)手工操作中,加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時);
3)加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外。解決辦法:①標(biāo)本為血清:最好將血液先自然存放1-2小時后,再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿:必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管,采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次,放置一段時間后,3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測,可放在2-8℃冰箱中,若要貯存,則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。②加樣后及時放入孵箱。③加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。④如果采用AT或其他全自動加樣,最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。⑤標(biāo)本較多時,請分批操作。
3 孵育 可能原因:
1) 孵育時未貼封片或加蓋,使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁,難于清洗徹底;
2) 孵育時間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗徹底。解決辦法:①貼封片或加蓋;②按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間。
4 洗板 可能原因:
1) 采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉;
2) 采用半自動洗板機(jī)洗板時,洗液量不足,導(dǎo)致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導(dǎo)致洗板效果差;
3) 反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。解決辦法:①保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;② 合理安排,或多用幾臺洗板機(jī)。
5 顯色 可能原因:
1) 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑;
2) 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。解決辦法:①顯色劑盡量在臨用前配制,堅持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用;②加樣時保持顯色劑不外流;③A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
6 終止 可能原因如加終止液時產(chǎn)生較多氣泡,導(dǎo)致假陽性增加。所以在加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
7 讀板 如讀板時板底不清潔等。應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。
所以在整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸; 盡可能實現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化,有效提高檢測質(zhì)量。
在實際操作中,除了選擇優(yōu)良試劑外,必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作,同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評,以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本,才能保證檢測質(zhì)量。現(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動酶標(biāo)儀,這對于實現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。