一.熒光強度與溶液濃度的關(guān)系
熒光是由物質(zhì)吸收光能后發(fā)射而出,因此,溶液的熒光強度 F 和溶液吸收光能的程度以及物質(zhì)的熒光頻率有關(guān):
F ∝(I0-It)→ F = K’(I0-It) (2)
K’ 為常數(shù),取決于熒光物質(zhì)的量子效率F,根據(jù)L—B定律:
所以 F = K’ ( I0-I010-ebc) = K’ I0 ( 1-10-ebc) = K’ I0 ( 1-e-2.303ebc ) (3)
將式中 e-2.303ebc 展開,得
(4)
當 2.303ebC£ 0.05 時(濃度很小,溶液較稀時),上式括號內(nèi)第一項以后的各項均可忽略不計,所以:
F = K’I02.303ebc (5)
對于一熒光物質(zhì)的稀溶液,當 I0 及 b 一定時,
F=K·c (6)
即在低濃度(2.303ebc £ 0.05)時,溶液的熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈(線性)正比關(guān)系。
二. 定量分析方法
1. 工作曲線法:
配制一系列濃度梯度的待測物的標準溶液,同空白溶液,使樣經(jīng)過相同的處理之后分別測定熒光強度:Fs、F0、Fx,然后作( Fs - F0)— c 曲線,根據(jù)(Fx–F0),從工作曲線上求得待測物的濃度(或含量)。
2. 直接比較法 :
如果熒光物質(zhì)溶液的工作曲線通過原點,就可選擇其線性范圍,用直接比較法進行測定:
Fs¯F0 = KcS , Fx¯F0 = Kcx (7)
三. 影響熒光強度的外界因素
1. 激發(fā)光源:一般選用lex 最大
但對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì),盡量采用長波長,低 I0 及短時間光照
2. 溫度:大多數(shù)分子在溫度升高時,分子與分子之間,分子與溶劑分子之間的碰撞頻率升高,非輻射能量轉(zhuǎn)移過程升高,F 降低,因此,降低溫度,有利于提高 F 。
3. 溶液的 pH:帶有酸性或堿性環(huán)狀取代基的芳香組化合物的熒光一般都與 pH 值有關(guān),有些化合物在離子狀態(tài)時不顯熒光。為此,在用熒光強度進行定量測定時,嚴格控制溶液 pH值是非常重要的。
4. 溶劑:對π
—π共軛的熒光物質(zhì)
在極性溶劑中,∆E 減小↓→ 躍遷幾率升高↑ → F↑(波長長移)
溶劑粘度 ↓ → F↓
5. 內(nèi)濾:當熒光波長與熒光物質(zhì)或其它物質(zhì)的吸收峰相重疊時,將發(fā)生自吸收使熒光物質(zhì)的熒光強度下降,此現(xiàn)象稱 “內(nèi)濾” 。
6. 散射光的影響(溶劑的二種散射)
(1)瑞利散射光:物質(zhì)(溶劑或其它分子)分子吸收光能后,躍遷到基態(tài)的較高振動能級,在極短時間(10-12s)返回到原來的振動能級并發(fā)出和原來吸收光相同波長的光,這種光稱為瑞利散射光。
(2)拉曼散射光:物質(zhì)分子吸收光能后,若電子返回到比原來能極稍高(或稍低)的振動能級而發(fā)射的光稱為拉曼散射光。
瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同,拉曼散射與激發(fā)光波長不同,而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān),因此可以通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。
7. 熒光熄滅劑的影響:
熒光熄滅:熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強度降低的現(xiàn)象。
熒光熄滅劑:引起熒光熄滅的物質(zhì)。
如:X-,重金屬離子、O2 、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。
尤其是溶液中的溶解氧能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象,因此,在較嚴格的熒光實驗中必須除O2 。
8. 表面活性劑的影響:提高熒光強度。