一、實驗原理
有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力,可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖,淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。
細(xì)菌產(chǎn)生的脂肪酶能分解培養(yǎng)基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培養(yǎng)基pH下降,可通過在油脂培養(yǎng)基中加入中性紅做指示劑進(jìn)行測試。中性紅指示范圍為pH6.8(紅)~8.0(黃)。當(dāng)細(xì)菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時,則菌落周圍培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點。
某些細(xì)菌分泌蛋白酶分解明膠,產(chǎn)生小分子物質(zhì)。如果細(xì)菌具有分解明膠的能力,則培養(yǎng)基可由原來固體狀態(tài)變成液體狀態(tài)。
牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。細(xì)菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時呈淡紫色,酸性時呈紅色,堿性時呈藍(lán)色,還原時則部分或全部脫色。細(xì)菌對牛乳的利用可分三種情況:
(1)酸凝固作用:細(xì)菌發(fā)酵乳糖后,產(chǎn)生許多酸,使石蕊牛乳變紅,當(dāng)酸度很高時,可使牛乳凝固,此稱為酸凝固。
(2)凝乳酶凝固作用:某些細(xì)菌能分泌凝乳酶,使牛乳中的酪蛋白凝固,這種凝固在中性環(huán)境中發(fā)生。通常這種細(xì)菌還具有水解蛋白質(zhì)的能力,因而產(chǎn)生氨等堿性物質(zhì),使石蕊變藍(lán)。
(3)胨化作用:酪蛋白被水解,使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下進(jìn)行,一般石蕊色素被還原褪色。
二、實驗材料
1、活材料:大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、黏乳產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes viscolactis)、銅綠假單胞菌(Psudomonas aeruginosa)、普通變形桿菌(Proteus vularis )。
2、培養(yǎng)基:淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加0.2%的可溶性淀粉;油脂培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加花生油10mL、0.6%中性紅水溶液1mL;明膠液化培養(yǎng)基:蛋白胨5g,明膠100~150g,水1000mL, pH7.2~7.4,115℃滅菌20min。石蕊牛乳培養(yǎng)基:牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8,121℃滅菌15 min 。
3、試劑:盧哥氏碘液。
實驗用品
平皿、接種環(huán)、酒精燈、試管、接種針等。
三、實驗方法
(一)淀粉水解試驗
1、準(zhǔn)備淀粉培養(yǎng)基平板:將熔化后冷卻至50℃左右的淀粉培養(yǎng)基倒入無菌平皿中,待凝固后制成平板。
2、接種:用記號筆在平板底部劃成兩部分,在每部分分別寫上菌名,用接種環(huán)取少量的待測菌,點接在培養(yǎng)基表面的相對應(yīng)部分的中心,其中一個菌種應(yīng)是枯草桿菌做對照菌。★你能解釋原因嗎?
3、培養(yǎng):將接種后的平皿置于28℃恒溫箱培養(yǎng)24h。
4、檢測:取出平板,打開平皿蓋,滴加少量的碘液于平板上,輕輕旋轉(zhuǎn),使碘液均勻鋪滿整個平板。菌落周圍如出現(xiàn)無色透明圈,則說明淀粉已經(jīng)被水解,表示該細(xì)菌具有分解淀粉的能力。可以用透明圈大小說明測試菌株水解淀粉能力的強(qiáng)弱。
(二)油脂水解試驗
1、將裝有油脂培養(yǎng)基的三角瓶置于沸水浴中熔化,取出并充分振蕩,使油脂均勻分布,再傾入無菌平皿中,待凝固成平板。
2、接種:于同一平皿的兩邊接種,其中一種是金黃色葡萄球菌作為對照菌。置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h,取出后觀察平板菌苔顏色,如果出現(xiàn)紅色斑點,即說明脂肪被水解了,此反應(yīng)為正反應(yīng)。紅色斑點大小說明測試菌株水解脂肪能力的強(qiáng)弱。
(三)明膠液化試驗
1、接種:用穿刺接種法接種大腸桿菌或產(chǎn)氣腸桿菌于明膠培養(yǎng)基中。
2、培養(yǎng):放20℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。若細(xì)菌在20℃下不長,則應(yīng)放在最適溫度下培養(yǎng)。
3、觀察結(jié)果:觀察培養(yǎng)基有無液化情況及液化后的形狀。
因明膠在低于20℃時凝固,高于25℃時自行液化,若是在高于20℃下培養(yǎng)的細(xì)菌,觀察時應(yīng)放在冰浴中觀察,若明膠被細(xì)菌液化,即使在低溫下明膠也不會再凝固。
(四)石蕊牛乳試驗
1、接種:將黏乳產(chǎn)堿桿菌和銅綠假單胞菌接種入石蕊牛乳培養(yǎng)基中。
2、培養(yǎng):將接種后的試管于37℃恒溫培養(yǎng)7d,另外保留一支不接種的石蕊牛乳培養(yǎng)基作為對照。
3、結(jié)果觀察:取出培養(yǎng)物,以不接種任何細(xì)菌的試管為對照,觀察接種不同細(xì)菌生長后的變化情況。