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    干貨|微生物檢測中培養(yǎng)基的質量控制措施!

    放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2020-05-27
    核心提示:培養(yǎng)基是液體、半固體或固體形式的,含天然或合成成分,用于保證微生物繁殖或保持其活力的物質。培養(yǎng)基的制備和使用是微生物實驗
    培養(yǎng)基是液體、半固體或固體形式的,含天然或合成成分,用于保證微生物繁殖或保持其活力的物質。培養(yǎng)基的制備和使用是微生物實驗室檢測工作的重要環(huán)節(jié),培養(yǎng)基自身質量的優(yōu)劣、保存是否得當、配制使用是否正確等都直接影響到檢測結果的準確性。本文對微生物實驗室在培養(yǎng)基購置、貯存、制備、使用等方面應采取的質量控制措施進行討論,談一些觀點和看法。希望有助于微生物檢測工作的同行們更好的開展工作。

    培養(yǎng)基的購置與驗收

    1.1 購置

    從培養(yǎng)基自身的質量來看,不同生產廠家的產品,甚至同一廠家不同批號的產品都會存在差異。依據(jù)ISO/IEC17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》,對培養(yǎng)基的供應企業(yè)進行評價后選擇合格的供應商,這是培養(yǎng)基購買過程中重要的步驟。應選擇產品市場信譽度高、有質量保證能力和服務保證能力的企業(yè);企業(yè)是否通過了質量管理體系的認證是較為客觀的評價指標。


    要求生產企業(yè)提供:培養(yǎng)基成分名稱及產品編號、批號、使用前的pH、儲藏信息和有效期、性能評價和所用測試菌株、技術數(shù)據(jù)清單、質控證書以及必要的安全/危害數(shù)據(jù)等材料。


    1.2 驗收

    購買的培養(yǎng)基到貨后,應有專人做好接受和驗收工作,應仔細核對生產企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱、規(guī)格數(shù)量、外觀特征、批號、保質期是否符合要求。每批培養(yǎng)基到貨后都應對培養(yǎng)基的質量進行檢測,滿足檢測方法規(guī)定的要求后方可投入使用。


    培養(yǎng)基的儲存

    干粉培養(yǎng)基應保存在陰涼干燥處,要避免陽光直射;未開瓶的培養(yǎng)基在室溫下的保存期限以廠家提供為準,開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕,應注意防潮并盡快用完。


     

    應定期對儲存中的培養(yǎng)基進行常規(guī)檢查,如容器密閉性復查、首次開封日期、內容物的感官檢查,如果培養(yǎng)基發(fā)生結塊、顏色異常和其他變質跡象就不能再使用。


    培養(yǎng)基的制備

    3.1 培養(yǎng)基用水

    培養(yǎng)基制備用水應使用電阻率不小于30萬Ωcm的蒸餾水或與其同質的水,最好不使用離子交換器生產的去離子水。


    3.2 稱量

    稱量時要用專用的角匙,避免交叉污染而影響檢驗結果;干粉培養(yǎng)基易吸潮,如有條件,盡量在濕度較低的房間稱取培養(yǎng)基。


    3.3 復水

    復水時不得用銅鍋或鐵鍋,以防有離子混入培養(yǎng)基中,影響微生物的生長;容器的大小需大于復水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上,避免在加熱溶解過程中,培養(yǎng)基溢出;含有瓊脂粉的培養(yǎng)基,在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘;加熱培養(yǎng)基時一定要進行攪拌,特別是瓊脂類培養(yǎng)基。為避免燒焦和沸騰溢出,對于少量的培養(yǎng)基最好使用沸水浴進行加熱。


    燒糊的培養(yǎng)基營養(yǎng)物質被破壞,并可產生有毒物質,如發(fā)現(xiàn)焦化,或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出,該培養(yǎng)基即不能使用,應重新制備。對于瓊脂類培養(yǎng)基進行再融化時應使用沸水浴或流動蒸汽進行加熱,最多只能加熱兩次,第二次再融化后仍未用完的培養(yǎng)基應棄去。


    3.4 滅菌

    一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌,即高壓蒸汽滅菌,通常是121℃ 15 min,含糖或特殊培養(yǎng)基,按照國家標準或生產商提供的說明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌,避免微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分,改變培養(yǎng)基的酸堿度。


    高溫可破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分,還會使瓊脂的凝膠強度下降,因此必須嚴格控制滅菌溫度和時間,并且不可重復滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進行檢定,并定期采用生物指示菌法或化學變色紙片對滅菌效果進行驗證。


    3.5 pH測定

    微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現(xiàn)其生物特性。培養(yǎng)基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH值,即培養(yǎng)基使用前的pH,并應在25℃溫度下采用精密酸度計進行測量,固體瓊脂培養(yǎng)基應以特殊的膠體表面測量電極進行測量。使用過程中,如果需要調整培養(yǎng)基的pH,應用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL調整,注意不可反復調pH,否則會影響培養(yǎng)基的滲透壓。


    3.6 配制好的培養(yǎng)基保存

    滅菌以后培養(yǎng)基應該迅速冷卻至所需溫度,避免長時間保存在滅菌鍋內,造成過度滅菌,影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分或選擇性效果。


    所配制的培養(yǎng)基的量,應該是在最長保存期限內正好使用完。含染料的培養(yǎng)基應閉光保存;倒好的瓊脂平板如果配制的當天未使用完,應于冷藏保存,如果保存時間超過2天,應將其放入密封的塑料袋中保存;配好的肉湯類培養(yǎng)基如果保存時間超過2個星期,應將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發(fā)。


    培養(yǎng)基的性能測試

    4.1 外觀控制

    制備好的培養(yǎng)基應有相應的顏色,一般的培養(yǎng)基應澄清、無渾濁、無沉淀。使用前應檢查培養(yǎng)基的顏色是否發(fā)生變化,是否蒸發(fā)/脫水。


    4.2 污染控制

    從每批制備好的培養(yǎng)基中選取部分進行污染測試(空白試驗),確定無微生物生長方可使用。


    4.3 性能測試

    4.3.1 測試菌株選擇: 測試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明實驗室特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株,應來自國際/國家標準菌種保藏中心ATCC標準菌株或其他有證書的菌株。


    4.3.2 定量測試方法: 改良Miles-Misra法。測試菌株過夜培養(yǎng)物10倍遞增稀釋;測試平板和參照平板劃分為4個區(qū)域并標記;從最高稀釋度開始,分別滴一滴稀釋液于試驗平板和對照平板標記好的區(qū)域;將稀釋液涂滿整個1/4區(qū)域,37°C培養(yǎng)18小時;對易計數(shù)的區(qū)域計數(shù),按公式計算生長率(生長率=待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)/參考培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù))。非選擇性培養(yǎng)基上目標菌的生長率應不低于0.7,該類培養(yǎng)基應易于目標菌生長;選擇性培養(yǎng)基上目標菌的生長率應不低于0.1 。


    4.3.3 半定量測試方法:改進的劃線法接種法。 平板分ABCD四區(qū),共劃16條線,平行線大概相隔0.5cm,每條有菌落生長的劃線記作1分,每個僅一半的線有菌落生長記作0.5分,沒有菌落生長或生長量少于劃線的一半記作0分,分數(shù)加起來得到生長指數(shù)G。目標菌在培養(yǎng)基上應呈現(xiàn)典型的生長,而非目標菌的生長應部分或完全被抑制,目標菌的生長指數(shù)G大于6時,培養(yǎng)基可接受 。


    4.3.4 定性測試方法 :平板接種觀察法。 用接種環(huán)取測試菌培養(yǎng)物,在測試培養(yǎng)基表面劃平行直線。按標準中規(guī)定的培養(yǎng)時間和溫度對接種后的平板進行培養(yǎng),目標菌應呈現(xiàn)良好生長,并有典型的菌落外觀、大小和形態(tài),非目標菌應是微弱生長或無生長 。


     

    另外對選擇性培養(yǎng)基還應選擇被抑制生長的菌株進行培養(yǎng)基驗收。


    附件:教你看懂培養(yǎng)基檢驗報告單(CoA)

    干粉類培養(yǎng)基的檢驗報告單主要包括以下內容,建議拿一份CoA結合本文閱讀。

    1. 感官

    一般包括色澤、氣味、形態(tài)、雜質等,屬于主觀評價。不同廠家產品會有不同。


    2.  理化

    a) 干燥失重或水分

    一般控制在5%-6%以內,不同廠家會有不同。結合水活度來說,這是控制培養(yǎng)基干粉微生物污染的重要手段。同時要關注密封情況,不能破壞水活度的環(huán)境。


    b)  凝膠強度

    這條僅限于是瓊脂類干粉培養(yǎng)基,一般描述為適宜或適中。因為瓊脂平板一般要倒置培養(yǎng),所以凝膠強度非常重要。而凝膠強度的高低也直接來源于瓊脂的質量。瓊脂是一種來源于海藻中,具有自然變異性的生物材料,并不是營養(yǎng)物質。主要應用于食品和制藥行業(yè),食品行業(yè)使用量最大,如果凍。細菌學瓊脂主要從石花菜中獲取,而目前全球正經歷石花菜的短缺。


    瓊脂質量也用凝膠強度來評價。瓊脂類培養(yǎng)基必須達到規(guī)定的凝膠強度才能實現(xiàn)穩(wěn)定倒置培養(yǎng)。如果加入的瓊脂本身的凝膠強度小,加入量就要增加。過多的加入瓊脂量不僅造成不必要的浪費而且會造成培養(yǎng)基過硬,直接影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收利用,而且培養(yǎng)基過硬時平板劃線容易產生裂痕,所以有時候并不是你的技術問題。從這個角度來說就很好理解為什么國外的一些標準中培養(yǎng)基的瓊脂用量是一個范圍,如每升培養(yǎng)基的瓊脂含量為12-20g,其實是根據(jù)所用瓊脂的凝膠強度不同來決定的。凝膠強度可以用凝膠強度測定儀直接檢測。

     

    c)澄清度

    溶解之后的澄清度情況,液體培養(yǎng)基尤其要關注這點。 


    d)pH值

    滅菌后在25℃的pH測定值。瓊脂類培養(yǎng)基必須采用平頭pH值測定儀測定。

     

    3. 微生物

     a)回收率

    接菌量在10-100cfu/ml,回收率標準同藥典標準。但是要注意對照培養(yǎng)基不一定是藥典用的中檢院推廣的對照培養(yǎng)基。有些國外生產培養(yǎng)基的對照培養(yǎng)基只是前一批次合格產品。


    b)質控菌

    菌落特征要符合標準,菌落顏色、大小、其他特征。生長情況描述為良好或者用+++表示。將質控菌稀釋到一定濃度后,使用定量接種環(huán)進行四區(qū)劃線后看結果,第四區(qū)能出現(xiàn)單個菌落并形態(tài)明顯最好。那+++是不是只代表只生長到第三區(qū)呢?你可以問問你的培養(yǎng)基供應商。


    c)抑菌情況

    分為部分抑制,完全抑制。也是用四區(qū)劃線法,一般部分抑制允許在第一區(qū)有部分菌落存在。但是接菌量有區(qū)別,有些是100-1000cfu/ml有些是1000-10000cfu/ml,要注意不同廠家的產品上會有說明。單從抑菌情況來說,如果接菌量越大抑制情況都可以達到越好,但是要結合生長情況考慮,很多抑菌成分如果過多也會對正常生長的菌產生影響。


    如何評價一份高質量的CoA?

    1.  結果有具體數(shù)字,如水分或干燥失重、pH、回收率、凝膠強度等。


    2. 在同樣的培養(yǎng)條件下生長情況能達到四區(qū)劃線都有。


    3.  抑制情況是該抑制的都抑制。


    4.有配套的MSDS,化學品安全技術說明書。

    一般的MSDS應該包括組分信息、急救措施、消防措施、泄漏應急處理、操作處置與儲存、接觸控制和個體防護、理化特性、穩(wěn)定性、毒理學信息、生態(tài)學信息、廢棄處置等。

    從安全操作的角度來說,MSDS告訴你保護自己和保護環(huán)境的有用信息。

    從穩(wěn)定操作角度來說,MSDS告訴你一瓶開蓋干粉培養(yǎng)基可以放置多久。

    從廢物處理角度來說,MSDS告訴你大量干粉應該如何處置。

    編輯:songjiajie2010

     
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